河南省教育厅自然科学基金(2009A320045)
- 作品数：5 被引量：6H指数：1
- 相关作者：许予明韩志强宋波赵莘瑜贾丽洁更多>>
- 相关机构：郑州大学第一附属医院郑州大学河南大学更多>>
- 发文基金：河南省教育厅自然科学基金河南省基础与前沿技术研究计划项目河南省卫生厅医学科技攻关计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响被引量：1
- 2010年
- HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。
- 刘玉涛宋波王亚仑许予明韩志强赵莘瑜贾丽洁
- 关键词：RNA干扰抗病毒
- 慢病毒介导APP695基因RNAi对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元β淀粉样蛋白分泌的影响被引量：3
- 2010年
- 目的 探讨慢病毒介导RNA干扰（RNAi）抑制APP695基因表达对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元细胞分泌β淀粉样蛋白（Aβ）的影响.方法 构建靶向APP695基因的短发夹状RNA（shRNA）慢病毒表达质粒（pFU-GW-iRNA）,进行酶切和测序鉴定.慢病毒表达质粒与包装质粒（pHelper 1.0和Helper 2.0）共转染293T细胞,获得病毒浓缩液并测定滴度.使用APP695-shRNA慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,设定为慢病毒介导阳性干扰（APP695-RNAi）组,另设阴性对照病毒感染（NC）组、未经病毒感染（CON）组.采用实时荧光定量PCR检测APP695基因mRNA的表达,Western印迹检测APP695蛋白的表达,采用Elisa检测Aβ40和Aβ42的生成.结果 PCR扩增和测序结果证实,APP695 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为5×108 TU/ml.使用慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,实时荧光定量PCR检测APP695-RNAi组APP695基因mRNA的抑制率为76.70%,与NC组和CON组相比差异有统计学意义（P＜0.001）.Western印迹结果显示蛋白水平表达下降与定量PCR一致.Elisa检测干扰72 h后APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ40的分泌分别为（184±15）ng/L、（647±30）ng/L、（656±40）ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义（均为P＜0.001） APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ42的分泌分别为（19.2±1.9）ng/L、（67.6±6.0）ng/L、（68.6±7.0）ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义（均为P＜0.001）.结论 慢病毒载体介导的APP695基因RNA干扰可以有效抑制痴呆小鼠皮质神经元细胞Aβ40和Aβ42的分泌.
- 赵莘瑜温丽君李国栋韩志强宋波许予明
- 关键词：基因慢病毒属
- 携带GFP绿色荧光标记的重组BAC-HSV-1 HF株的构建及其子代病毒的特性研究被引量：1
- 2011年
- 本研究旨在构建由细菌人工染色体(Bacteria artificial chromosome,BAC)携带的单纯疱疹I型病毒质粒及携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的重组型BAC-HSV-1感染性子代病毒。构建了携带HSV-1同源臂的质粒C223-UL43左臂-UL47右臂。将该质粒线性化后与HSV-1基因组共转染至Vero细胞,通过真核细胞内同源重组产生了含有GFP报告基因的BAC-HSV-1重组病毒,噬斑纯化筛选出阳性重组病毒,并再次感染Vero细胞,Hirt法提取BAC-HSV-1环形基因组并将其电穿孔入DH10B感受态细胞,由PCR和酶切法鉴定BAC-HSV-1质粒。为研究BAC-HSV-1子代病毒的生物学特性,将实验组和对照组细胞分别给予BAC-HSV-1质粒和HSV-1基因组DNA,收取病变细胞的上清液,以MOI=0.1再次感染Vero细胞,半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose,TCID50)法测定两组的病毒滴度。PCR和酶切法分别鉴定BAC-HSV-1,结果示BAC-HSV-1构建成功。TCID50法测定实验组和对照组病毒滴度,经统计学分析两组病毒滴度间差异无统计学意义(P>0.05)。本研究成功地构建了真核细胞和原核细胞间穿梭的HSV-1-BAC重组病毒/质粒。
- 刘新静宋波卢甲盟王青志韩志强许予明
- 关键词：细菌人工染色体单纯疱疹病毒I型
- siRNA干扰立早蛋白ICP4对HSV-1病毒复制能力的影响被引量：1
- 2010年
- 目的观察siRNA作用于HSV-1病毒的ICP4后对HSV-1复制能力的影响。方法设计两段靶向HSV-1 ICP4的siRNA和一段阴性对照序列,酶切连接法构建重组质粒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;脂质体法包装重组慢病毒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;嘌呤霉素筛选法建立抗ICP4的siRNA单克隆细胞系(VERO115、VERO3604、VERO115+3604、VERO-CON);TCID50法检测siRNA对HSV-1的病毒复制能力的影响。结果成功构建重组质粒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;获得重组慢病毒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;成功构建四个抗ICP4的siRNA单克隆细胞系;BAC-HSV-1-GFP病毒感染单克隆细胞系,siRNA作用后野生型VERO细胞的细胞病变效应(CPE)及绿色荧光蛋白(GFP)表达率均近100%,VERO-CON细胞达90%以上。siRNAVERO115及VERO3604的CPE及GFP表达率明显高于VERO115+3604细胞,P<0.05。且不同位点联合干扰对病毒的抑制作用强于单一位点干扰,低于VERO115和VERO3604,P<0.05。结论抗ICP4的siRNA对HSV-1的复制有明显的抑制作用,且不同位点siRNA联合干扰对病毒的复制有协同抑制效果。
- 刘玉涛王喜宋波许予明韩志强赵莘瑜贾丽洁王亚仑
- 关键词：病毒复制
- HSV-1HF株扩增子载体的构建及其在不同HSV血清型间的通用性研究
- 2011年
- 旨在构建HSV-1HF株的扩增子载体,研究其在不同血清型HSV辅助下的包装通用性。经酶切HF株的BAC-HSV-1,获得oriS和pac元件并测序。以pSilencer2.0-U6为骨架,以DsRed为报告基因构建HSV-1HF株的扩增子载体,利用脂质体2000转染扩增子载体至Vero细胞,分别应用HSV-1HF株和HSV-2HG52辅助HSV-1扩增子载体进行包装,待产生细胞病变效应后取上清,再次感染Vero细胞,观察Vero细胞内红色荧光蛋白表达情况。本研究首次构建了HSV-1HF株的扩增子载体,鉴定了HSV-1HF株oriS和pac元件,HSV-1HF株扩增子载体可以被HSV-1HF株和HSV-2HG52株包装并扩增。
- 宋波刘新静韩志强赵璐王青志卢甲盟许予明
- 关键词：单纯疱疹病毒I型HSV-1HSV
