国家自然科学基金(30672322)
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
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- 变形链球菌ComE蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化
- 2009年
- 目的:构建变形链球菌comE基因原核表达载体,诱导ComE融合蛋白高效表达,获取高质量的ComE融合蛋白。方法:提取变形链球菌基因组,PCR扩增得到变形链球菌comE基因片段,BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后定向克隆到pET28a(+)表达载体中,并转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导融合蛋白表达,Western blot鉴定表达产物。进行蛋白表达的可溶性鉴定,并优化诱导时菌液的A600值、IPTG浓度、诱导时间和温度4个表达条件。然后用优化的条件大量诱导表达ComE融合蛋白,采用镍柱和分子筛两步法进行纯化。结果:经PCR、双酶切反应以及测序鉴定,重组质粒中的插入序列为comE基因的全长片段(753bp),无碱基的突变与读码框架的偏移。Western blot证实表达产物确为6×His-ComE融合蛋白,相对分子质量约为33000。目的蛋白在上清和沉淀中均有表达,且当A600为0.4时,加入IPTG至终浓度0.10mmol/L,37℃诱导4h后表达量最大。结论:成功构建pET28a(+)-comE原核表达载体,用优化后的6×His-ComE融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达条件,获得纯化的变形链球菌ComE融合蛋白。
- 彭磊刘筱娣郭丽宏
- 关键词：变形链球菌原核表达蛋白纯化密度感应
- 变形链球菌反应调控蛋白ComE结合序列的初步筛选被引量：1
- 2010年
- 目的:从变形链球菌基因组中筛选反应调控蛋白ComE结合的核酸序列。方法:⑴提取变形链球菌UA159基因组,进行超声剪切处理。以基因组片段为模板,用随机引物进行延伸,切胶纯化和PCR扩增后获得基因组文库。⑵应用基因组SELEX技术,以ComE蛋白为靶物质,与变形链球菌基因组文库共同孵育,循环筛选8轮。筛选产物TA克隆后送去测序,测序结果进行生物信息学分析。⑶将分析得到的2个序列分别克隆入pFW5-luc载体中,然后分别重组到变形链球菌UA159野生株和comE突变株的基因组中,采用RT-PCR的方法检测luc片段的表达。结果:⑴获得了变形链球菌UA159的基因组文库,片段范围约为100～300bp。⑵随机挑取54个克隆送去测序,经生物信息学分析和RT-PCR初步验证,最终获得1个ComE蛋白可能的结合序列。结论:采用基因组SELEX技术,筛选反应调控蛋白ComE可能的结合序列,并进行了初步验证,为后续进行变形链球菌反应调控蛋白ComE调控机制的研究奠定了基础。
- 彭磊吴丹黄博刘筱娣郭丽宏
- 关键词：变形链球菌
- SELEX技术筛选变形链球菌UA159适配子可行性的研究被引量：2
- 2012年
- 目的:研究SELEX技术用于筛选口腔致龋菌适配子的可行性。方法:化学合成长度为35mer的随机ssDNA文库,利用SE-LEX技术,分别以变形链球菌UA159(以下简称变链UA159)、乳杆菌和离心管作为靶物质,筛选适配子,不对称PCR扩增筛选产物,所得适配子进行克隆、测序,分析其二级结构,并对其二级结构进行了初步分析。结果:显示各个靶物质的筛选产物在第二轮筛选时就已经表现出具有特征性的二级结构。结论:SELEX技术可以用于口腔致龋菌适配子的筛选。
- 黄博彭磊王帅刘筱娣郭丽宏
- 关键词：SELEX乳杆菌适配子
