国家自然科学基金(30070300)
- 作品数：14 被引量：82H指数：4
- 相关作者：刘乃丰吴国球刘勇王明虹顾秀峰更多>>
- 相关机构：东南大学中国药科大学天津市第四中心医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省自然科学基金教育部科学技术研究重点项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化被引量：1
- 2008年
- 目的:利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的小肽。方法:设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段,插入pET-32(a)+质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游,构建重组质粒,转入E.coliBL21表达菌中,用终浓度1mmol.L-1的IPTG诱导表达融合蛋白;用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化,然后用亲和层析进一步纯化,经肠激酶切割,最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽;用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果:所构建的重组质粒测序结果与预期一致;诱导表达后用SDS-PAGE鉴定,发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现,与预期一致;融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化,得率分别为78.6%和52.3%;用亲和层析纯化得率为50.5%;经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽,用反相色谱鉴定其纯度大于95%;最终每升发酵液获得3.4 mg目的肽。结论:成功制备CT-GF特异性结合肽,为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。
- 王明虹吴国球刘乃丰
- 关键词：结缔组织生长因子分离纯化
- 糖基化终产物对大鼠主动脉平滑肌细胞结缔组织生长因子表达的影响被引量：3
- 2009年
- 目的研究糖基化终产物对结缔组织生长因子（CTGF mRNA）及蛋白质表达的影响，探讨糖基化终产物致动脉粥样硬化机制。方法采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞。反转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测血管平滑肌细胞结缔组织生长因子mRNA及蛋白质的表达。结果随着糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）的干预浓度（100、200、400mg／L）升高，CTGF mRNA的表达水平呈上升趋势，分别为（0．78±0．03）、（1．15±0．03）、（1．40±0．04）mg／L，与未干预（0．40±0．02）mg／L比较，差异有统计学意义（P％0．05），不同浓度间差异亦有统计学意义（P〈0．05）。以200mg／L的AGE-BSA对平滑肌细胞分别干预0、4、8、16、24、48、72h，发现4h时CTGF mRNA表达即已升高（0．93±0．04）rag／L，8h时最高（1．29±0．04）mg／L，以后虽略有下降，但仍维持较高水平。结论糖基化终产物促进血管平滑肌细胞表达结缔组织生长因子，可能是其致动脉粥样硬化机制中的一个重要方面。
- 顾秀峰张寰刘勇刘乃丰
- 关键词：糖基化终产物血管结缔组织生长因子
- 人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选被引量：4
- 2007年
- 目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。
- 吴国球刘乃丰赵桂琴范小波张臣王明虹
- 关键词：结缔组织生长因子噬菌体展示
- 糖基化终产物对人血管内皮细胞基质金属蛋白酶-2表达和活性的影响
- 2012年
- 目的探讨糖基化终产物(AGEs)对人血管内皮细胞ECV304基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达和活性的影响。方法应用AGEs作用ECV304细胞后,采用RT-PCR法及明胶酶图分析方法分析MMP-2表达和活性与AGEs浓度和时间的关系。结果 RT-PCR结果显示,AGEs能够诱导ECV304细胞表达MMP-2,其诱导表达具有浓度和时间依赖性(P<0.01)。明胶酶图分析显示,MMP-2降解明胶的活性与AGEs具有浓度依赖性。结论 AGEs能够促进ECV304细胞MMP-2的表达和活性,推测AGEs调控MMP-2表达和活性可能在血管壁内皮细胞影响动脉粥样硬化的进展中发挥一定的作用。
- 刘勇张寰顾秀峰李焕明刘乃丰
- 关键词：糖基化终产物人血管内皮细胞基质金属蛋白酶-2
- 氨基胍与葛根素对糖尿病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的影响被引量：15
- 2005年
- 目的 :探讨结缔组织生长因子 (CTGF)在糖尿病肾病发病中的作用及葛根素 (Pue)和氨基胍 (AG)对其表达的干预作用。方法 :将 60只雄SD大鼠随机均分成正常对照组、糖尿病组、氨基胍组和葛根素组 ,腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型。氨基胍组在建模基础上喂食氨基胍进行干预 ,葛根素组采用腹腔注射葛根素干预。逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学法观察各组肾组织中CTGF基因和蛋白的表达。结果 :糖尿病大鼠肾皮质CTGF GAPDHmRNA之值为 0 .44± 0 .0 3 ,明显高于葛根素组的 0 .2 2± 0 .0 2和氨基胍组的 0 .2 3± 0 .0 2 (均P <0 .0 1) ,后两组又高于正常对照组的 0 .16± 0 .0 2 (均P <0 .0 1)。免疫组织化学法显示 ,正常对照组大鼠肾小球CTGF阴性 ,葛根素组和氨基胍组染色相近 ,强于正常对照组 ,但显著弱于糖尿病组。结论 :糖尿病大鼠肾皮质CTGF表达增强 ,可能部分参与糖尿病肾病的发生发展过程 ,氨基胍和葛根素降低CTGF表达的作用可能是其肾脏保护的机理之一。
- 顾秀锋陆静刘乃丰
- 关键词：氨基胍葛根素CTGF糖尿病大鼠GAPDH
- 羧甲基赖氨酸的研究进展被引量：8
- 2005年
- 晚期糖基化终末产物(AGEs)是蛋白质、脂质或核酸等大分子物质的非酶糖基化产物。其在体内有多种不同的存在形式,研究最多的是羧甲基赖氨酸(CML),它是AGEs的主要抗原表位,体内分布广泛,在糖尿病并发症等病变和衰老的发生、发展中有重要作用。
- 魏芹刘乃丰
- 关键词：赖氨酸表位
- 糖基化终产物对人血管内皮细胞过氧化体增殖物激活型受体γ基因表达的影响被引量：1
- 2004年
- 为探讨糖基化终产物对人血管内皮细胞表达过氧化体增殖物激活型受体γ基因的影响 ,体外培养人血管内皮细胞株 (ECV30 4 ) ,分别用不同浓度葡萄糖 (0、2 0、5 0和 80mmol L)孵育的糖基化终产物修饰牛血清白蛋白(2 0 0mg L)、不同浓度的糖基化终产物修饰牛血清白蛋白 (5 0、10 0、2 0 0和 4 0 0mg L)干预 2 4h和葡萄糖浓度为 5 0mmol L孵育的糖基化终产物修饰牛血清白蛋白干预细胞 0、12、2 4、36、4 8和 72h ,逆转录聚合酶链反应检测细胞中过氧化体增殖物激活型受体γmRNA的表达水平。结果发现 ,葡萄糖浓度为 2 0、5 0和 80mmol L孵育的糖基化终产物修饰牛血清白蛋白及浓度为 5 0、10 0、2 0 0和 4 0 0mg L的糖基化终产物修饰牛血清白蛋白都减少过氧化体增殖物激活型受体γmRNA的表达 (P <0 .0 0 1) ,干预 12、2 4、36、4 8和 72h后过氧化体增殖物激活型受体γmRNA表达均较未干预组明显减少 (P <0 .0 0 1)。此结果提示 ,糖基化终产物可抑制人血管内皮细胞过氧化体增殖物激活型受体γ基因的表达。
- 刘勇刘乃丰
- 关键词：细胞生物学糖尿病糖基化终产物过氧化体增殖物激活型受体Γ基因表达
- 抗稻瘟病水稻材料谷梅2号中主效抗稻瘟病基因的成簇分布被引量：39
- 2004年
- 应用由籼稻组合中 15 6 /谷梅 2号衍生的 30 4个重组自交系 ,构建了由 177个标记组成、覆盖 12条水稻染色体的连锁图谱 ,定位控制水稻稻瘟病抗性的主效基因。前期定位的控制对中国稻瘟菌菌系 92 183(小种ZC1 5)穗瘟抗性的基因Pi2 5 (t)的位置得到进一步确认 ,位于第 6染色体标记A7和RG4 5 6之间 ,与A7和RG4 5 6的遗传距离分别为 1.7和 1 5cM ;发现群体对菲律宾稻瘟菌菌系Ca89(4谱系 )的叶瘟抗性由单基因控制 ,将该暂命名为Pi2 6 (t)的基因定位于第 6染色体标记B10和R6 74之间 ,与B10和R6 74的遗传距离分别为 5 .7和 2 5 .8cM。两个基因座位上的抗病等位基因均来源于谷梅 2号 ,表明谷梅 2号中存在控制水稻稻瘟病抗性的基因簇。
- 吴建利柴荣耀樊叶杨李德葆郑康乐Hei LEUNG庄杰云
- 关键词：稻瘟病水稻抗病品种抗病基因分子定位
- 糖基化终产物对小鼠胚胎成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响被引量：3
- 2007年
- 目的:探讨糖基化终产物(AGEs)对NIH Swiss小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中结缔组织生长因子(CTGF)基因表达的影响,并观察氨基胍(AG)、葛根素(Pue)对NIH/3T3中CTGF mRNA表达的干预作用。方法:葡萄糖和牛血清白蛋白(BSA)共同孵育制备AGEs,运用荧光法测定AGEs水平。用不同浓度葡萄糖(20、50和80 mmol.L-1)制备的AGEs培养NIH/3T3细胞24 h;用50 mmol.L-1葡萄糖制备的AGEs培养NIH/3T3细胞0、6、12、24和48 h。观察AG和不同浓度Pue(0.25、0.5、1.0和1.5g.L-1)的干预作用。应用RT-PCR检测NIH/3T3中CTGF mRNA的表达。结果:与BSA对照组比较,用20、50和80 mmol.L-1葡萄糖制备的AGEs培养24 h后,NIH/3T3中CTGF mRNA表达增高(P<0.01),以50 mmol.L-1最明显。与0 h比较,同一浓度葡萄糖制备的AGEs培养6、12、24及48 h后,NIH/3T3中CTGF mRNA的表达增高(P<0.01),以24 h最明显。与50 mmol.L-1葡萄糖制备的AGEs培养24 h比较,AG和不同浓度的Pue干预后NIH/3T3中CTGF mRNA的表达明显降低(P<0.01)。结论:AGEs能增强NIH/3T3中CTGF基因表达,且与孵育AGEs的葡萄糖浓度和作用时间有关,提示AGEs可能促进糖尿病并发症纤维化的发展,AG和Pue可抑制AGEs促纤维化的病理过程。
- 郦琳琳刘乃丰张丽容
- 关键词：糖基化终产物结缔组织生长因子氨基胍
- 十二肽库中与结缔组织生长因子特异结合噬菌体的筛选被引量：1
- 2007年
- 目的:从随机十二肽库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆。方法:用基因重组方法制备硫氧化还原蛋白(TrxA)以及硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白;噬菌体肽库经TrxA预吸附后,与TrxA-CTGF结合,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取10个克隆,提取单链DNA后测序;用直接和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆与CTGF结合的特异性。结果:10个克隆中8个DNA序列完全一致(810A),另有2个有不同序列(810B,810C);3个阳性克隆用直接和间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.05)。结论:成功获得与CTGF特异结合的噬菌体克隆,为CTGF小分子抑制剂的研究打下基础。
- 吴国球王明虹张臣刘乃丰
- 关键词：结缔组织生长因子噬菌体展示抑制剂
