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中蜂囊状幼虫病毒VP1基因在杆状病毒表达系统中的表达被引量：2: 2013年; 目的利用杆状病毒系统表达中蜂囊状幼虫病毒(chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP1基因。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫总RNA,RT-PCR法扩增VP1基因,克隆至载体pFastBacI中,构建重组转座质粒pFastBacI-VP1,转化至感受态大肠埃希菌DHl0Bac中,获得重组杆粒rBacmid-VP1,转染至昆虫细胞sf9中,获得第1代重组杆状病毒,经透射电镜观察杆状病毒粒子;病毒连续传代3次后,RT-PCR鉴定重组杆状病毒,SDS-PAGE检测VP1蛋白的表达情况,Western blot检测表达产物的反应原性。结果重组杆粒经PCR鉴定构建正确;第1代重组杆状病毒经透射电镜观察,可见杆状病毒粒子;重组杆状病毒以M13通用引物和VP1基因特异引物进行PCR扩增,分别可见3 263和963 bp的片段,大小均与理论值一致;CSBV VP1基因能够在sf9细胞中表达,表达的重组VP1蛋白相对分子质量约31 000,可与兔抗CSBV-VP1阳性血清发生特异性反应。结论成功利用杆状病毒表达系统表达了CSBV VP1基因,为深入研究CSBV的感染机制和蜜蜂的免疫机制以及中蜂囊状幼虫病血清诊断试剂盒的研制奠定了基础。; 费东亮马鸣潇程健; 关键词：VP1基因杆状病毒表达系统

中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立被引量：15: 2010年; 目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。; 马鸣潇李明袁春颖李鹏飞张轶博苏玉虹曲祖乙; 关键词：反转录聚合酶链式反应特异性敏感性

中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白预测与鉴定被引量：4: 2011年; 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、生物信息学软件和质谱分析对中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)辽宁株(CSBV-LN)全基因组进行了分子克隆、序列测定、分子生物学特性分析及结构蛋白预测和鉴定.结果表明,CSBV-LN全基因组序列长度为8863个核苷酸,编码一个大的开放阅读框,其中包括178 nt的5'非编码区的前导序列和79 nt的3'非编码区,后面跟着一个poly(A)的尾巴.通过软件分析表明,CSBV-LN蛋白序列类似于哺乳动物的小RNA病毒蛋白序列,预计存在VP1,VP2,VP3和VP4等4个小的结构蛋白;系统进化分析表明,CSBV、囊状幼虫病毒(SBV)和残翅病毒(DWV)的起源相同,推测CSBV有着类似DWV的结构蛋白序列5'-VP2-VP4VP1VP3-3.基于此,根据PAGE蛋白条带的大小,利用NetPicoRNA软件预测结构蛋白的裂解位点.在此基础上,对纯化后的CSBV进行SDS-PAGE分离,对分离到的4个蛋白进行质谱分析,结果鉴定出VP1,VP3和VP0 3个蛋白.; 马鸣潇马臣程健谢振声李明费东亮; 关键词：反转录聚合酶链反应结构蛋白质谱分析

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP3蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测被引量：2: 2012年; 目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构。在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域。结论预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础。; 费东亮毛靖宇宋英今马鸣潇; 关键词：空间结构 B细胞抗原表位

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测被引量：5: 2011年; 目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。; 程健张佩马鸣潇李明杨松; 关键词：空间结构

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