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猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析被引量：5: 2005年; 目的:克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法:以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究。结果:共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号:AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%。荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达。结论:获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。; 孙世惠周艳荣卢建申邓继先; 关键词：血清白蛋白基因文库聚合酶链反应绿色荧光蛋白

猪血清白蛋白基因5′端调控区的克隆与分析被引量：1: 2009年; 根据已报道的hsa(人血清白蛋白基因)启动子序列设计了一对引物,以猪的基因组DNA为模板,采用PCR扩增出一条256 bp DNA片段,用Primer Premier5.0和Promoter Scan软件进行分析。结果表明,此序列为psa基因5′-端上游包括启动子在内的调控区,该区域含有一般启动子典型的CAAT-box、TATA-box等基本顺式作用元件。另外,还含有CTF/NF-1、CTF、APF、HNF-1、CP1等转录因子的结合位点。; 李勃熊海燕陈红星邓继先; 关键词：基序上游调控区启动子

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建被引量：3: 2009年; 目的:构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法:将劳氏肉瘤病毒增强子/启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的5'端长重复序列(LTR)、HIV-1ψ包装信号、HIV Rev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、ΔU3/3'LTR、牛生长激素(BGH)基因poly(A)依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果:酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论:为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。; 于永生罗晓彤吴晓洁周艳荣陈红星邓继先; 关键词：慢病毒载体

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达被引量：4: 2007年; 利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。; 董焕声房勇卫李兰李晓林孙理兰翟向玮潘庆杰沈伟; 关键词：转基因动物体外受精

关中奶山羊BAC文库构建条件研究被引量：1: 2004年; 　BAC(bacterialartificialchromosome,细菌人工染色体)是一种新发展起来的构建高等生物基因组文库的重要方法。由于关中奶山羊产奶性能好,成为制备乳腺生物反应器的理想动物之一,故对关中奶山羊BAC文库的构建条件进行了研究。用BamH 部分酶切关中奶山羊的基因组,用CHEF(箝位匀强电场)凝胶电泳分离大片段DNA,以电透析法回收DNA后,与酶切脱磷的pBeloBAC11载体连接,然后电激转化感受态细胞DH10β,得到了数千个阳性克隆,插入片段平均为30～40kb。在此过程中摸索了BAC载体制备、高分子量DNA制备、酶切、连接和电激转化等一系列环节对高效转化产生大片段DNA克隆的影响。; 贾玉艳陈宏邓继先; 关键词：关中奶山羊 BAC文库基因组文库细菌人工染色体乳腺生物反应器

精子整合外源DNA的分子机制与转基因动物的制备: 2005年; 利用精子载体法制备转基因动物是一种简便、可行的研究和应用方法,但精子结合并内化转运外源DNA却具有非常复杂的机制。从精子结合外源DNA的物质基础及分子机制,外源DNA在精子细胞中的存在和降解等方面展开探讨,并着重探讨了外源DNA在精子基因组中的整合机制。另外,基于理论研究的进展讨论了转基因动物的制备策略。; 孙玉江王丽李兰潘庆杰; 关键词：转基因动物精子载体

人血清白蛋白基因的打靶研究: 2007年; 为获得整合有人血清白蛋白(HSA)基因的猪胎儿成纤维细胞克隆,从猪基因组文库中杂交筛选得到猪血清白蛋白(PSA)基因全序列35kb并克隆了人血清白蛋白cDNA序列,扩增猪血清白蛋白基因5′调控序列7.2kb片段及第一内含子至第四内含子2.8kb的片段;构建了含有neo及tk正负筛选标记基因的人血清白蛋白基因打靶载体,并验证了neo基因的有效性。将线性化的打靶载体通过电击转染的方法整合到猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418及GANC进行细胞克隆的抗药性筛选,PCR及Southern blot鉴定抗药性细胞克隆,最终获得3个发生同源重组的细胞克隆。这为下一步进行体细胞核移植制备生产人血清白蛋白转基因猪奠定了基础。; 孙世惠周艳荣陈红星林艳丽黄培堂邓继先; 关键词：基因克隆基因打靶

利用多重筛选机制提高山羊乳腺上皮细胞基因打靶的效率被引量：8: 2005年; 构建了山羊β 酪蛋白基因座基因打靶载体pGBC GFP neo,载体包含了正负筛选标记基因neo和tk,以及无启动子的GFP基因。打靶载体线性化后用脂质体包裹转染山羊乳腺上皮细胞,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,共得到抗性细胞克隆 51个,对抗性克隆利用激素诱导β 酪蛋白基因启动子指导GFP表达,得到GFP表达阳性细胞克隆 17个,对其中 4个生长状态良好的克隆PCR检测验证后用于核移植,克隆胚发育率为 59 5%,部分发育到桑椹胚或囊胚。; 沈伟闵令江李兰潘庆杰吴晓洁周艳荣邓继先; 关键词：山羊基因打靶乳腺生物反应器 Β-酪蛋白基因

体细胞克隆猪的研究与展望被引量：2: 2005年; 用体细胞核移植的方法生产的克隆猪诞生至今已近5年,虽然同胚胎细胞核移植相比,体细胞核移植技术难度大,成功率低,但近年来用体细胞核移植技术克隆猪有了更深入的研究,在体细胞核移植基本机理和关键技术上取得了一定的进展。综述了用核移植的方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况,并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。; 刘珠果邓继先; 关键词：克隆猪体细胞核移植技术

外源基因对精子的影响及其在山羊早期胚胎中的表达被引量：4: 2008年; 在前期实验中发现,山羊精子可自发结合外源DNA,但结合能力在不同动物个体之间差异显著。挑选结合能力明显不同的3只公羊,进一步探讨了外源DNA对精子的影响及其在早期胚胎中的表达,结果发现:外源基因与精子共同孵育后,精子的活率、顶体反应发生率和受精能力均呈下降态势,其降幅与精子的结合能力密切相关。利用与DNA共育后的精子进行体外受精,外源基因可被导入卵母细胞并在早期胚胎中获得表达,但胚胎阳性率因精子供体不同而差异显著(P<0.05);其中来源于高、中结合能力供体生产的胚胎,分别有16.2%(25/154)和5.3%(4/76)可检测到外源基因存在,但表达仅见于高结合能力供体生产的早期胚胎,表达率为6.5%(10/154);低结合能力供体生产的胚胎无外源基因。研究表明,在以精子载体方法生产转基因动物的实验过程中,筛选对DNA结合能力较强的精子供体是提高转基因效率的前提,但需要考虑外源DNA对精子受精能力的影响。; 叶华虎董罡袁菊芳隋丽华胡娟峰李瑞生刘彦马啸陈振文曾林; 关键词：精子胚胎山羊

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国家高技术研究发展计划(2002AA206621)

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