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苹果sMdCAX1基因超表达载体的构建及遗传转化被引量：3: 2016年; 为使sMdCAX1基因能在苹果中高效表达,改善苹果对Ca^(2+)吸收转运的能力,本研究构建了sMdCAX1植物超表达载体并将其通过农杆菌介导法转入长富6号苹果中。根据MdCAX1基因序列设计引物,从长富6号中克隆MdCAX1基因,通过PCR方法截除编码MdCAX1基因的N末端序列,获得sMdCAX1片段。利用重叠PCR方法将sMdCAX1序列中的SacI位点进行定点突变,并在序列两端分别添加BamHI和SacI酶切位点,获得长度为1272bp的突变序列sMd1+2Mu。利用BamHI和SacI双酶切sMd1+2Mu和植物表达载体pYH4215,目的片段经回收、连接、转化和筛选,获得植物双元表达载体pYH4215-sMd1,并将该载体转化农杆菌菌株EHA105。以长富6号无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化获得了转基因植株,经鉴定,有6个株系呈GUS染色阳性,其中2个株系呈PCR阳性。进一步对PCR鉴定阳性的株系进行RT-PCR分析,表明sMdCAX1基因在这2个株系中得到表达。本试验结果为进一步研究苹果MdCAX1基因的功能和通过转基因方法提高苹果果实钙含量奠定了基础。; 张璐刘帅魏萌涵蔡斌华王三红; 关键词：苹果

苹果CAX基因家族生物信息学和表达分析被引量：7: 2015年; [目的]CAX（Ca^2＋/H＋exchanger antiporter）是一类重要的跨膜转运蛋白,在植物体内阳离子转运上起着非常重要的作用。本文对苹果MdCAXs基因进行了生物信息学和组织特异性表达分析,以期为该类基因的功能研究奠定基础。[方法]利用生物信息学的方法对苹果MdCAXs基因家族染色体定位、蛋白质等电点、亲疏水性、跨膜区域、亚细胞定位及保守结构域进行了预测和分析,同时还分析了MdCAXs基因与其他物种CAXs基因的进化关系。采用实时荧光定量PCR法对苹果MdCAXs基因在不同盐处理下根、茎、叶中的表达变化进行分析。[结果]苹果MdCAXs家族包含8个成员,分别属于CAXsⅠ型中的A亚型和B亚型,编码436-817个氨基酸,等电点4.97-7.12,且都为疏水性蛋白;所有MdCAXs基因编码的氨基酸都有11个及以上的跨膜区域,含有CAXs基因5个典型的功能域：N-端自抑制区域（NRR）、C-端功能区域、Ca^2＋功能域（CaD）、C功能域和D功能域。亚细胞定位预测MdCAXs主要是定位在质膜和内质网上。苹果MdCAXs基因具有组织特异性表达特点,不同种类盐处理根、茎、叶中表达发生不同程度的变化,反映了MdCAXs存在功能上的差异,对不同阳离子有特异性的应答反应。[结论]苹果MdCAXs是一类跨膜转运蛋白,具有植物CAXs基因典型的结构特征,根、茎、叶对不同的盐离子具有不同的表达响应。; 蔡起华朱玉春张璐刘帅竹龙鸣蔡斌华章镇王三红; 关键词：苹果生物信息学

Genomic variants of genes associated with three horticultural traits in apple revealed by genome re-sequencing被引量：5: 2014年; The apple(Malus×domestica Borkh.)cultivar‘Su Shuai’exhibits greater disease resistance,shorter internodes and lighter fruit flavor compared with its parents‘Golden Delicious’and‘Indo’.To obtain a comprehensive overview of the sequence variation in these three horticultural traits,the genomes of‘Su Shuai’and‘Indo’were resequenced using next-generation sequencing and compared to the genome of‘Golden Delicious’.A wide range of genetic variations were detected,including 2454406 and 18749349 single nucleotide polymorphism(SNP)and 59547 and 50143 structural variants(SVs)in the‘Indo’and‘Su Shuai’genomes,respectively.Among the SVs in‘Su Shuai’,17 genes related to disease resistance,10 genes related to Gibberellin(GA)and 19 genes associated with fruit flavor were identified.The expression patterns of eight of the SV genes were examined using reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).The results of this study illustrate the genomic variation in these cultivars and provide evidence for a genetic basis for the horticultural traits of disease resistance,short internodes and lighter flavor exhibited in these cultivars.These results provide a genetic basis for the phenotypic characteristics of‘Su Shuai’and,as such,these SVs could serve as gene-specific molecular markers in maker-assisted breeding of apples.; Shijie ZhangWeiping ChenLu XinZhihong GaoYingjun HouXinyi YuZhen ZhangShenchun Qu; 关键词：CULTIVAR TRAITS

苹果叶片受斑点落叶病菌侵染过程中细胞Ca^(2+)定位及MdCPK的表达被引量：3: 2015年; 以苹果感病品种‘红星'和抗病品种‘红玉'为材料,研究了苹果与斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype)互作过程中超微结构,细胞Ca^(2+)分布,以及在钙信号转导途径中具有重要作用的钙依赖蛋白激酶基因(CDPK)的表达,探讨钙信号在苹果防御斑点落叶病菌侵染中的作用。结果表明,在未接种状态下,叶肉细胞结构完好,叶绿体呈卵圆形沿细胞边缘排列,Ca^(2+)主要分布在细胞间隙和液泡中,‘红玉'细胞间隙Ca^(2+)密度比‘红星'大。接种斑点落叶病菌8h,‘红星'叶肉细胞中的Ca^(2+)沉淀主要分布在胞质中,而液泡等细胞器中减少;‘红玉'的Ca^(2+)沉淀主要集中在胞质和筛管分子中,液泡和细胞间隙中减少,且趋向于在细胞壁外围和液泡膜上沉积。接种18 h,‘红星'叶肉细胞间隙Ca^(2+)沉淀密度增加,而‘红玉'中的Ca^(2+)沉淀主要集中在叶肉细胞的胞质和液泡,以及筛管分子中。接种24 h,‘红星'叶肉细胞结构已发生形变,质膜发生裂解,筛管壁木质化加厚,Ca^(2+)沉淀主要分布在液泡中;‘红玉'叶片细胞结构完好,Ca^(2+)沉淀主要分布在液泡和胞质中。接种36 h,‘红星'叶肉细胞受到菌丝入侵,结构和形态遭到破坏,在未受损叶肉细胞中Ca^(2+)沉淀主要集中在液泡中,在受损的细胞中Ca^(2+)沉淀无序地散布在受损细胞周围及细胞间隙;此时‘红玉'叶肉细胞中Ca^(2+)沉淀主要集中在胞质和液泡中,并且能够保持Ca^(2+)动态平衡。在接种后不同阶段,‘红星'和‘红玉'叶片中MdCPKs基因呈现不同的表达特点:大多MdCPKs在‘红玉'中的表达量在24 h达到最高值;‘红星'中在36 h达到表达峰值,且表达量也比‘红玉'中低得多。上述结果表明,钙信号响应斑点落叶病菌侵染,在抗病苹果品种‘红玉'中,Ca^(2+)内流是细胞质Ca^(2+)上升的主要来源;在感病品种‘红星'中,细胞器Ca^(2+)释放是细胞质Ca^(2+)的主要来源。; 魏萌涵倪维晨竹龙鸣蔡斌华王三红; 关键词：苹果

基于转录组测序的湖北海棠抗白粉病机制分析被引量：4: 2021年; 为研究湖北海棠[Malus hupehensis(Pamp)Rehd.]响应白粉病菌胁迫过程中相关基因的表达及分子机制,取同一时期爆发白粉病的‘青砧1号’、‘青砧1号’/湖北海棠嫁接苗的接穗部分和湖北海棠等3份材料的叶片,使用BGISEQ-500测序技术对其进行转录组测序分析。结果表明:青砧1号、青砧1号/湖北海棠和湖北海棠对白粉病的抗性依次增加;GO富集显示代谢过程和催化活性相关的GO term在青砧1号、青砧1号/湖北海棠和湖北海棠中被显著富集;KEGG分析显示亚油酸代谢、植物病原体相互作用、磷酸肌醇代谢、油菜素类固醇生物合成和磷脂酰肌醇信号系统等5条代谢途径在‘青砧1号’/湖北海棠和湖北海棠中均显著富集,碳代谢途径只在抗性强的湖北海棠中显著富集。与白粉病抗性相关基因家族表达分析显示,WRKY70、WRKY33、NPR3和WRKY40等转录因子基因在青砧1号/湖北海棠和湖北海棠中较青砧1号显著上调表达。实时荧光定量PCR结果证实了转录组测序结果的准确性。; 兰黎明罗昌国王三红; 关键词：湖北海棠砧木白粉病转录组

苹果响应斑点落叶病菌的蛋白质组学研究: 苹果是世界范围内栽培最广泛的果树树种之一。但是，苹果的产量和品质受到病害的严重影响。苹果斑点落叶病(Alternaria blotch)就是其中的一种，它由链格孢苹果专化型(Alternaria alternata ap...; 倪维晨; 关键词：苹果斑点落叶病病菌侵染抗性反应

湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析被引量：17: 2013年; 为了分析 WRKY40 抗病抗逆作用,以湖北海棠[Malus hupehensis(Pamp)Rehd.]为试材,利用特异引物进行 RT-PCR 基因克隆,利用实时荧光定量 PCR 方法分析组织中基因的表达及低温、高盐、干旱、PEG6000 胁迫和外源 IAA、ABA 处理对基因表达的影响。结果表明,克隆到的片段长度为 1 240 bp,包含一个完整的开放阅读框,长 999 bp,编码 333 个氨基酸。该基因与拟南芥 AtWRKY40 同源,故命名为 MhWRKY40b,GenBank 登录号为 JX112913。基因表达分析表明,MhWRKY40b 在根、茎、叶等组织均有表达,其中在花萼、花辨、果实中表达量较高。该基因明显受低温、高盐、干旱胁迫诱导表达,最高相对表达量可达 20 倍以上;而受 PEG、苹果白粉病菌及外源 ABA 和 IAA 轻微诱导,最高相对表达量在10 倍以下。MhWRKY40b 除了在抗白粉病方面与 AtWRKY40 具有相似功能外,可能还在湖北海棠的抗寒、抗盐、抗旱过程中起到比较重要的作用。; 罗昌国渠慎春张计育王三红乔玉山张仕杰刘丹章镇; 关键词：湖北海棠 WRKY 转录因子抗逆性抗病性

苹果WRKY基因家族的鉴定、表达分析及MdWRKY118基因的功能验证: WRKY蛋白是一类存在于高等植物中的转录因子，具有十分广泛的作用，直接或间接参与植物生长、发育等生理过程，并且在植物应答非生物胁迫和生物胁迫中扮演着重要角色。本研究通过对苹果WRKY基因家族的鉴定和分析，解析其成员间的进...; 刘帅; 关键词：苹果 WRKY基因基因表达

苹果细菌人工染色体双色DNA纤维荧光原位杂交体系的建立及应用被引量：1: 2014年; 【目的】建立苹果DNA纤维荧光原位杂交(Fiber FISH)技术体系,从而为利用该技术确定苹果基因组DNA序列间的位置关系、构建精细物理图谱等方面的应用奠定基础。【方法】以‘Florina’苹果幼叶为试材,通过液氮研磨,尼龙膜过滤和TritonX-100去除叶绿素等步骤提取细胞核。细胞核经碱裂解,采用盖玻片拉伸方法制备DNA纤维。比较细胞核不同裂解时间和在5种不同包被类型的载玻片上DNA纤维拉伸的效果。用碱裂解方法提取来自苹果‘Florina’自交不亲和S9基因座的4个细菌人工染色体(Bacterium Artificial Chromosome)BAC 34G16、BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的质粒经PEG纯化,用地高辛或生物素标记探针。探针与DNA纤维制片经过80℃变性、37℃杂交2—3 d和洗片,采用"三明治"方法进行信号放大和检测,在荧光显微镜下观察试验结果。【结果】建立了以苹果幼叶为材料,液氮研磨提取细胞核,碱裂解细胞核和盖玻片拉伸制备DNA纤维的试验方法。提取的细胞核纯净、结构完整,细胞核浓度>5×103个/μL。试验结果表明,细胞核裂解4 min,在多聚赖氨酸包被的载玻片上制备的DNA纤维平直、伸展均匀,纤维量多、细长,效果好。经原位杂交和信号检测,获得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的"念珠状"杂交信号。对已知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19进行杂交信号测量和分析,得出BAC克隆大小(Y,Kb)与信号长度(X,μm)的相关方程为Y=3.47X(R2=0.9215),其斜率即为该试验技术体系Fiber FISH的分辨率3.47 kb·μm-1。试验对未知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地进行了鉴定,它们大小分别为(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3)kb,之间有(90.2±7.3)kb的重叠区域。【结论】建立了以苹果幼叶提取细胞核,制备DNA纤维和原位杂交的方法,获得了高分辨率的苹果DNA纤维原位杂交试验技术体系。; 王三红章镇蔡斌华渠慎春; 关键词：苹果细菌人工染色体

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国家自然科学基金(31171935)

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