国家科技重大专项(2009zx09503-019)
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 相关作者：杨月峰王立生王华李泽良肖凤君更多>>
- 相关机构：军事医学科学院第四军医大学第四军医大学西京医院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 腺病毒-甲病毒杂合载体的构建
- 2010年
- 目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下:利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子(CD11a promoter,CD11Ap)、甲病毒载体元件(nsP)、目的基因(GFP)、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数(100MOI)分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP+细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP+细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。
- 李泽良王华杨月峰肖凤君鲁茁壮王立生
- 关键词：腺病毒科甲病毒属复制子基因转移技术
- 重组质粒pUDK-PmL-IR-GM的体内免疫激活作用
- 2011年
- 目的构建携带融合蛋白基因PSA-IZ-mCD40L(PmL)和GM-CSF基因的重组质粒载体pUDK-PmL-IR-GM,并评价其小鼠体内免疫激活作用。方法采用类似基因合成的方法将前列腺特异性抗原基因、异亮氨酸拉链基因和鼠源性CD40配体基因连接并扩增获得融合蛋白基因PmL。将GM-CSF、PmL和核糖体内部进入位点基因依次克隆到pUDK载体,获得重组质粒pUDK-PmL-IR-GM。分别于第1、11、21和35天免疫小鼠,末次免疫后10d分离小鼠脾脏T淋巴细胞。采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群;MTT法检测前列腺特异性抗原刺激下的T淋巴细胞增殖效应;非放射性细胞杀伤检测试剂盒检测对LNCaP细胞的特异性杀伤作用。结果 PCR成功扩增GM-CSF基因和融合蛋白基因PmL,并将其克隆至pUDK载体上,以核糖体内部进入位点连接,得到重组质粒pUDK-PmL-IR-GM。pUDK-PmL-IR-GM免疫小鼠后,T淋巴细胞性能检测显示:CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比值较对照组明显升高(P<0.05);前列腺特异性抗原刺激后,其增殖能力明显增强(与阴性对照相比,P<0.01),且明显高于其他免疫组(P<0.01);其对LNCaP细胞杀伤效率大于25%,且明显强于pUDK免疫组(P<0.05)。结论成功构建重组质粒载体pUDK-PmL-IR-GM,并证实其能在一定程度激活小鼠T淋巴细胞的特异性免疫反应。
- 杨月峰王华肖凤君徐洁李庆芳严俊王立生
- 关键词：前列腺特异抗原CD40配体T淋巴细胞亚群
- 携带miR29c重组腺病毒的制备及其促骨髓瘤细胞凋亡作用被引量：2
- 2012年
- 目的制备携带miR29c的重组腺病毒Ad5F11p-miR29c,评价miR29c对骨髓瘤细胞凋亡的影响。方法巢式PCR扩增得到hsa-miR29c,将hsa-miR29c基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,得到pShuttle-CMV-miR29c。鉴定正确后,PmeI线性化并转化含Ad5F11p骨架质粒的BJ5183感受态细胞,重组获得腺病毒载体。PacI线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞,制备重组腺病毒Ad5F11p-miR29c。以对照病毒Ad5F11p-EGFP感染人骨髓瘤细胞系SKO-007、U266和XG7,通过流式细胞术确定最佳感染复数。Ad5F11p-miR29c以最佳感染复数感染骨髓瘤细胞,流式细胞术检测miR29c对细胞凋亡的影响。结果 PCR扩增获得miR29c基因,成功将其连接到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,经测序鉴定正确。采用Ad-easy系统,成功构建并制备了CMV启动的重组腺病毒Ad5F11p-miR29c。流式细胞术结果显示,Ad5F11p-EGFP对SKO-007和U266细胞的最佳感染复数为150MOI;而XG7为100MOI。Ad5F11p-miR29c以最佳感染复数感染细胞48h后,细胞凋亡率升高。SKO-007细胞的凋亡率达到26.5%,XG7细胞的凋亡率达到46.9%。结论成功制备重组腺病毒Ad5F11p-miR29c,并证实miR29c能够诱导骨髓瘤细胞凋亡。
- 张怡堃王华杨萍李泽良杨月峰陈协群王立生
- 关键词：微RNAS腺病毒科骨髓瘤
