上海市科学技术委员会资助项目(024119111)
- 作品数：2 被引量：4H指数：1
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- 人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定被引量：4
- 2006年
- 目的:采用多聚酶链反应及酶切鉴定,拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体,以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。方法:实验于2004-05/2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118.BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,酶切回收的BMP-7/GFP基因片段,克隆入pAxCAwt腺病毒载体后,共转染大肠杆菌LE393,获得腺病毒重组质粒,大量扩增后转入293细胞包装,获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞,293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。结果:①骨形态发生蛋白7基因的获得:KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带,略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因,略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3.1BMP-7/GFP的构建:所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带,全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT.BMP-7.GFP的构建:所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带,为正向插入的阳性克隆。结论:多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建,并包装出重组腺病毒,为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。
- 毕霞徐卫东吴岳嵩
- 关键词：骨形态发生蛋白质类腺病毒科基因表达转染
- 人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的制备及在骨髓基质干细胞中的表达
- 2006年
- 目的：构建骨形态发生蛋白7(BMP-7)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺病毒载体,并检测其在骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达。方法：RT-PCR法获得BMP-7基因。将其克隆至pcDNA3．1/CT-GFP质粒中,PCR扩增hBMP-7／GFP融合基因片段,与线性化pAxCAwt腺病毒载体连接,转染大肠杆菌LE392,筛选重组腺病毒黏粒,大量扩增后与DNA-TPC共转HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad．hBMP-7/GFP。用重组病毒液转染兔BMSCs细胞,免疫组化方法检测BMP-7的表达。结果：经过多聚酶链反应及酶切鉴定证明获得了BMP-7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,滴度为4．4×108pfu/ml。荧光显微镜和免疫组织化学证明BMP-7在重组腺病毒转染后的BMSC细胞中得到了表达。结论：成功制备BMP-7重组腺病毒,为骨缺损局部基因治疗研究奠定基础。
- 毕霞徐卫东吴岳嵩龚德军袁扬黄盛东
- 关键词：骨形态发生蛋白质类重组腺病毒骨髓祖代细胞
