贵州省教育厅自然科学研究项目(20090105)
- 作品数：5 被引量：5H指数：2
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- 空肠弯曲菌peb1A与大肠埃希菌ltB基因融合基因的构建、表达及鉴定
- 2015年
- 目的采用重叠PCR方法将大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位ltB基因和空肠弯曲菌外膜蛋白peb1A基因进行连接,构建ltB-peb1A融合基因原核表达系统,对其进行诱导表达与鉴定。方法利用PCR技术扩增ltB与peb1A基因,用重叠PCR法将ltB与peb1A基因进行融合,然后插入pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET28a(+)-LtB-peb1A。用重组体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白LTB-PEB1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,ELISA法鉴定其与牛Gm1活性,Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果 PCR及测序证实ltB-peb1A融合基因原核表达载体pET28a(+)-LtB-peb1A构建成功,SDS-PAGE分析目的蛋白最高表达量占全菌总蛋白的28%左右,其分子质量单位为40.7ku。ELISA法鉴定纯化的重组蛋白与牛Gm1有结合活性,Western blot分析重组蛋白能被兔抗空肠弯曲菌识别。结论成功构建了ltB-peb1A融合基因原核表达载体,并获得高效表达的目的蛋白,为空肠弯曲菌黏膜免疫疫苗的研制奠定了基础。
- 杜联峰夏墙余妍杨瑞宋明英孙万邦
- 关键词：LTB基因黏膜佐剂基因融合
- 空肠弯曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A壳聚糖佐剂疫苗对小鼠免疫原性和保护性研究被引量：3
- 2012年
- 目的:研究空肠弯曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A壳聚糖佐剂疫苗的免疫原性和保护性。方法:健康雄性昆明小鼠分为实验组和对照组。实验组设pcDNA3.1(-)-peb1A组3个剂量和壳聚糖-pcDNA3.1(-)-peb1A组3个剂量;对照组设空载体pcDNA3.1(-)(100μg/100μl)组和生理盐水(NS)组,各组均采用小鼠股四头肌注射法。在第0、10、20天免疫,于每次免疫后第10天采集各组小鼠血清,以间接ELISA法检测血清中特异性IgM、IgG的含量。分离各组小鼠脾淋巴细胞包被细胞培养板,以细胞ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞CD20、CD21表达水平。设空肠弯曲菌液灌胃攻击免疫后小鼠,检测肠道分泌液细菌培养数量。结果:裸DNA组和壳聚糖-DNA组各组特异性IgG水平均高于两对照组(P<0.05)。裸DNA组和壳聚糖-DNA组小鼠脾淋巴细胞CD20、CD21表达水平均高于两对照组(P<0.05),壳聚糖-DNA组高于裸DNA组(P<0.05)。肠道分泌液细菌培养结果细菌指数裸DNA组的低于两对照组;佐剂DNA组低于裸DNA组。结论:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性和保护作用,壳聚糖能增强pcDNA3.1(-)-peblA的免疫原性,有望成为空肠弯曲菌基因疫苗的候选佐剂。
- 徐岗村杜联峰孙万邦王宜峰王胜香罗军敏姚新生夏嫱杨瑞余妍
- 关键词：空肠弯曲菌壳聚糖免疫原性
- 猪脾转移因子的制备和生物学活性研究被引量：2
- 2016年
- 目的:采用冻融-透析法制备猪脾转移因子,并对其理化性质以及免疫学生物学活性、生物安全性进行初步检定。方法:采用低温匀浆反复冻融新鲜的猪脾脏、无菌离心匀浆脾脏组织液,取上清液透析制备转移因子;以改良Lowry法分别检测多肽含量,并进行理化指标、无菌试验、热原质试验及其生物学活性检测。结果:冻融-透析法制备猪脾转移因子的理化性状符合《中国生物制品》的要求;无菌试验、热原质试验均为阴性;安全试验合格;淋巴细胞转化试验和E花环形成试验证实其具有刺激淋巴细胞增殖生物学活性。结论:成功制备了猪脾脏转移因子,其各项理化指标符合生物制品规程的要求,同时具有较好的非特异性免疫学的生物学活性。
- 杜联峰夏嫱余妍杨瑞郭锦锦孙万邦朱进军
- 关键词：理化性质
- 空肠弯曲菌DNA疫苗构建及其疫苗免疫程序研究
- 2012年
- 目的:构建空肠弯曲菌peb1A基因真核表达载体,探讨DNA疫苗不同免疫程序的免疫效果。方法:以重组pET28a(+)-peb1A质粒为模板,将空肠弯曲菌peb1A基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染COS-7细胞中表达,Western blot鉴定表达蛋白;昆明小鼠随机分组:设空白对照组、空载体对照组、pcDNA3.1(-)-peb1A实验组,用ELISA法检测免疫后的昆明小鼠血清IgG和IgM抗体水平。结果:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经双酶切和PCR鉴定,构建正确。peb1A基因测序结果与GenBank中peb1A基因序列一致。重组质粒成功转染COS-7细胞,并能正确表达重组蛋白。裸DNA组IgG水平均高于两对照组,有显著性差异(P<0.05)。同一剂量短时间(0、10、20天)免疫程序优于长时间(0、15、25、35天)免疫程序(P<0.05)。结论:成功构建空肠弯曲菌真核表达重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A,其经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性,短时间免疫程序免疫效果好。
- 杜联峰徐岗村孙万邦王宜峰王胜香罗军敏姚新生夏嫱杨瑞余妍
- 关键词：空肠弯曲菌免疫程序
- 空肠弯曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A壳聚糖佐剂疫苗的Th免疫应答及作用
- 2012年
- 目的:探讨以壳聚糖为佐剂的空肠弯曲菌基因疫苗免疫小鼠后的Th细胞免疫应答状态。方法:昆明小鼠随机分组:设空白对照组、空载体组、pcDNA3.1(-)-peb1A组、壳聚糖+pcDNA3.1(-)-peb1A组,各组均采用小鼠股四头肌注射法。在第0、10、20天免疫,于每次免疫后第10天采集各组小鼠血浆,间接ELISA法检测免疫后不同时间小鼠血浆中Th1、Th2细胞因子的含量。结果:Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ,在第10、20、30天,裸DNA组、佐剂DNA组、空载体组及NS组两两相比均无显著性差异(P>0.05);Th2类细胞因子IL-4、IL-10:实验组高于两对照组,在IL-4的检测中有显著性差异(P<0.05),在IL-10的检测中裸DNA组高于空白对照组有显著性差异(P<0.05),其裸DNA组高于空载体组,仅在第20天有显著性差异(P<0.05);佐剂DNA组高于裸DNA组,在IL-4的检测中有显著性差异(P<0.05),在IL-10的检测中,仅在第10、20天有显著性差异(P<0.05);佐剂DNA组高于两对照组,有显著性差异(P<0.05)。结论:以壳聚糖为佐剂的空肠弯曲菌基因疫苗可促进Th2细胞为主的免疫反应。
- 杜联峰孙万邦王宜峰徐岗村余妍夏嫱杨瑞
- 关键词：空肠弯曲菌基因疫苗壳聚糖细胞因子
