卫生部科学研究基金(WKJ2005-2-011)
- 作品数：8 被引量：28H指数：4
- 相关作者：张志坚陈东平吴秀丽张彦定林建华更多>>
- 相关机构：福建医科大学福建师范大学厦门大学更多>>
- 发文基金：卫生部科学研究基金福建省自然科学基金福建医科大学科学研究发展基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 血管生长素-1基因慢病毒载体的构建及其在间质干细胞的表达被引量：7
- 2007年
- 目的:构建带有血管生长素-1(Ang-1)基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)中的表达。方法:RT-PCR获得大鼠Ang-1基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒并感染rMSCs。PCR检测Ang-1基因的插入,细胞RT-PCR检测Ang-1mRNA表达,免疫细胞化学和Western blotting检测Ang-1蛋白的表达。结果:所获Ang-1基因经测序证实与GenBank报道的序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES2-EGFP经SaⅠl和BamHⅠ双酶切后电泳显示1 512 bpAng-1目的基因片段和10.5 kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1mRNA表达。免疫细胞化学和Western blotting检测到Ang-1蛋白表达。结论:成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体并实现在rMSCs中的表达,为Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了基础。
- 陈柏龄张志坚黄东煜吴秀丽张彦定
- 关键词：间质干细胞
- 经静脉移植骨髓间质干细胞在脑缺血前后大鼠脏器组织中的分布被引量：6
- 2007年
- 目的:骨髓章质干细胞通过局部直接注射或经静脉、动脉移植均可有效趋化到达脑缺血、损伤组织,但目前除了对到达靶部位的干细胞分布有一定了解外,对干细胞在非损伤组织或损伤组织之外的其它部位迁移分布与生存情况的研究较少。观察经静脉移植的大鼠骨髓间质干细胞在脑缺血前后大鼠体内的生存与分布,为干细胞移植研究提供实验基础和可能的理论依据。方法:实验于2006-05/2007-05在福建省神经病学研究所完成。实验材料:选取清洁级健康雄性近交系F344大鼠48只,体质量250～300g,由中国利学院上海实验动物中心提供,按随机数字表法分为3组;正常移植组、脑缺血前移植组、脑缺血后移植组,每组16只。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验方法:①体外培养扩增2月龄F344大鼠骨髓间质干细胞,传至第三四代备用。用带增强型绿荧光蛋白基因的慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞。②建立大鼠短暂大脑中动脉闭塞脑局灶缺血模型。取增强型绿荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞,经股静脉移植入大鼠体内。正常移植组:细胞移植前大鼠未经任何处理;脑缺血前移植组:先在正常大鼠静脉移植细胞,24h后行大脑中动脉闭搴术;脑缺血后移植组:大鼠先行大脑中动脉闭塞术,24h后移植细胞。③实验评估:采用改良的神经功能缺损量表测定各组大鼠神经功能情况;取大鼠骨髓制作涂片,同时取脑、心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、小肠组织标本制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白阳性细胞在各时间点的分布情况。结果:48只大鼠均进入结果分析。①脑缺血前移植组和脑缺血后移植组大鼠神经功能在移植后12周内均有明显恢复,但脑缺血后移植组恢复较快,术后1,3,12周明显优于脑缺血前移植组(P<0.01,P<0.05)。②在正常移植组和脑缺血前前移植组大
- 陈东平张志坚吴秀丽林建华
- 关键词：间质干细胞脑缺血
- SDF-1/CXCR4增强骨髓间质干细胞的造血支持作用被引量：4
- 2008年
- 目的探讨基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)支持CD34+造血干/祖细胞(HSPCs)扩增中的作用。方法在长期培养基(LTC)中,以大鼠骨髓MSCs作为饲养层体外扩增骨髓CD34+细胞,每周分别加入SDF-1、SDF-1抗体或CXCR4抗体至5周。计算CD34+细胞数和集落形成细胞(CFC)数,以评价造血支持功能。为评估SDF-1/CXCR4对CD34+细胞增殖周期的影响,进行了杀伤试验以计算增殖指数。流式细胞术检测MSCs和CD34+细胞中SDF-1与CXCR4的表达;ELISA检测MSCs和CD34+细胞培养基中SDF-1的含量。结果CD34+细胞数、CFC数和增殖指数在加入SDF-1后明显增加(P<0.01),加入SDF-1抗体或CXCR4抗体后明显减少(分别为P<0.05,P<0.01)。CD34+细胞表面表达CXCR4,MSCs则不表达;MSCs细胞内表达SDF-1,而CD34+细胞不表达。在MSCs培养基中检测到SDF-1,在CD34+细胞培养基中未发现。结论SDF-1/CXCR4在骨髓MSCs支持HSPCs扩增中起重要作用。
- 陈东平张志坚吴秀丽林建华
- 关键词：间质干细胞基质细胞衍生因子-1CXCR4
- SDF-1/CXCR4与骨髓干细胞移植治疗脑卒中被引量：1
- 2007年
- 陈东平张志坚
- 关键词：骨髓祖代细胞趋化因子细胞运动
- 慢病毒载体介导血管生长素1基因修饰骨髓间充质干细胞对颈动脉粥样硬化的影响
- 2009年
- 背景:骨髓间充质干细胞易于被外源基因转染,且具有向损伤组织趋化聚集的特性,便于将目的基因导入其中并发挥治疗性作用,可以通过分化为血管内皮细胞修复损伤的血管内膜。目的:探讨慢病毒载体介导的血管生长素1基因修饰骨髓间充质干细胞移植后,对大鼠颈动脉粥样硬化的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-02/2008-05在福建省高血压研究所及福建医大附属第一医院中心实验室完成。材料:4周龄雄性SD大鼠32只,8只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余24只随机分为3组:模型对照组、空载体组、血管生长素1转染组,8只/组。方法:以重组慢病毒为载体构建血管生长素1基因工程干细胞,以绿色荧光蛋白为报告基因,调整细胞密度为(1.0～2.0)×1010L-1。3组大鼠均采用球囊损伤法+高脂饮食构建颈动脉粥样硬化模型,造模后即刻,空载体组将未感染的0.1mL骨髓间充质干细胞悬液注入颈总动脉外膜,分3点注射;血管生长素1转染组同法注入等量重组慢病毒感染的骨髓间充质干细胞悬液,饲养2个月后处死大鼠,取颈动脉组织。主要观察指标:Western blot法检测转基因干细胞中血管生长素1的表达,荧光免疫组织化学及苏木精-伊红染色检测动脉内膜/中膜面积比。结果:24只大鼠均进入结果分析。血管生长素1转染组表达血管生长素1蛋白,另2组无血管生长素1蛋白表达。移植后2个月,荧光显微镜下空载体组、血管生长素1转染组动脉壁内均可见绿色荧光蛋白阳性细胞;各组均可见动脉内膜增生,斑块形成;与模型对照组比较,空载体组内膜面积/中膜面积值无明显变化(P>0.05),血管生长素1转染组内膜面积/中膜面积值明显减小(P<0.05)。结论:经血管生长素1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植可明显减轻动脉粥样硬化程度。
- 侯炳波王挹青郭晋村王淼张鹏
- 关键词：干细胞动脉粥样硬化
- 共表达EGFP和CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞的构建及其迁移能力被引量：1
- 2010年
- 目的构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)及CXCR4慢病毒载体,并实现其在大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)中的表达,观察转CXCR4基因后对rMSCs迁移能力的影响。方法 RT-PCR扩增大鼠CXCR4编码区片段,将其插入慢病毒载体质粒PNL-IRES2-EGFP,获得的PNL-CXCR4-IRES2-EGFP与包装及包膜质粒用脂质体法共转染293T细胞,包装生产慢病毒。所获慢病毒转染rMSCs后,用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光组织化学和流式细胞术检测转CXCR4基因rMSCs组、转空载体rMSCs组中CXCR4表达情况。利用Transwell方法检测两组rMSCs在SDF-1作用下的迁移能力。结果双酶切和测序证实,PNL-CXCR4-IRES2-EGFP构建正确,转CXCR4基因rMSCs组CXCR4表达明显增多,在SDF-1α作用下迁移能力明显增强。结论成功构建带有EGFP和大鼠CXCR4的慢病毒载体,并获得CXCR4-rMSCs基因工程细胞,为深入研究SDF/CXCR4轴在rMSCs向损伤组织定向迁移中的作用奠定了基础。
- 俞晓岚张志坚吴秀丽黄志新
- 关键词：CXCR4EGFP慢病毒骨髓间充质干细胞
- 大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达被引量：10
- 2009年
- 为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用,构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs(rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列,设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面,产生pRiCXCR4,将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP,产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后,用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示,酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确,产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP,未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后,与空载体组和空白组相比,3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达,CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%,抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功,为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。
- 陈东平张志坚吴秀丽张彦定
- 关键词：慢病毒CXCR4RNA干扰骨髓间质干细胞
- 血管生长素-1基因修饰骨髓间充质干细胞对黏附因子表达的影响被引量：2
- 2008年
- 目的探讨血管生长素1(Ang1)基因转导的骨髓间充质干细胞(Ang1-rMSC)对内皮细胞黏附因子表达的影响。方法经慢病毒载体介导构建Ang1-rMSC,观察VEGF刺激下不同时间点人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)黏附分子VCAM-1和ICAM-1表达的动态改变。采用RT-PCR及Western blot技术检测黏附分子mRNA及蛋白质水平的表达变化。结果HUVEC在20μg/L VEGF刺激下,ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平显著升高,8h达到峰值,与对照组相比分别增加4.2倍及3.2倍。不同浓度上清液孵育的HUVEC在VEGF刺激后,ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达均较对照组下降;含70%Ang1-rMSC上清液孵育的HUVEC,VCAM-1与ICAM-1表达较单纯VEGF组显著下降。结论Ang1-rMSC上清液可抑制VEGF诱导的HUVEC黏附分子表达,通过Ang1基因修饰Ang1-rMSC用于抑制干细胞移植伴发的炎症反应具有可行性。
- 郭晋村王挹青谢良地许昌声
- 关键词：黏附分子骨髓间充质干细胞
