国家自然科学基金(30972198C180503)
- 作品数：14 被引量：27H指数：3
- 相关作者：王兴龙王景龙屈海龙王秀然张瑞更多>>
- 相关机构：军事医学科学院吉林大学北京奶牛中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室开放基金更多>>
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- 羊型布氏菌WbkC基因真核表达质粒的构建及鉴定被引量：5
- 2011年
- 目的构建羊型布氏菌脂多糖O-侧链合成必需的甲酰基转移酶WbkC基因真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取16M株羊型布氏菌基因组DNA,PCR扩增WbkC基因,克隆至psos载体上,构建诱饵重组质粒psos-WbkC,转化酵母菌株cdc25Hα,进行菌落PCR鉴定,并检测其在酵母双杂交系统中的自激活和定位情况。结果诱饵重组质粒psos-WbkC经PCR双酶切及测序证明构建正确;重组酵母菌经PCR鉴定,可扩增出约780 bp的目的基因;诱饵质粒在酵母双杂交系统中无自激活且定位正确。结论已构建了羊型布氏菌WbkC基因真核表达质粒psos-WbkC,可应用于酵母双杂交系统中,用于寻找巨噬细胞cDNA文库中与WbkC相互作用的蛋白质。
- 王景龙屈海龙王秀然郎需龙李晓艳王兴龙
- 关键词：真核细胞基因表达
- 羊布鲁菌膜蛋白的提取及血清抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：1
- 2010年
- 目的提取羊布鲁菌标准强毒株16m膜蛋白,分析其反应原性,并建立血清抗体间接ELISA检测方法。方法利用碳酸盐方法提取羊布鲁菌标准强毒株16m膜蛋白,12%SDS-PAGE分析其相对分子质量范围;用自然感染羊布鲁菌的阳性血清进行Westernblot分析,初步确定膜蛋白组分中能够发生免疫反应的条带;用方阵滴定法确定抗原和抗体的最佳稀释度,建立间接ELISA检测方法,并进行特异性和精密性验证;检测免疫豚鼠的血清抗体效价;对临床上采集的羊血清样品进行检测,并与虎红平板凝集试验结果进行比较。结果分离的羊布鲁菌膜蛋白浓度为9.4μg/μl;SDS-PAGE分析显示,羊布鲁菌膜蛋白的相对分子质量主要集中在17000～80000之间;Westernblot分析显示多条特异性反应条带。膜蛋白抗原的最佳稀释度为1∶1280,抗体最佳稀释度为1∶10。所建立的ELISA方法特异性和精密性良好。ELISA检测豚鼠血清效价为1∶64000。检测临床510份羊血清样品,阳性率为86.3%,高于虎红平板凝集试验检出的阳性率(41.2%)。结论已成功提取了羊布鲁菌膜蛋白,其具有良好的反应原性,并建立了血清抗体间接ELISA检测方法。
- 杨艳玲唐婕白光彦盛雪玲王成福王兴龙
- 关键词：膜蛋白反应原性间接ELISA
- 羊布氏菌SOD基因重组酿酒酵母菌株的构建及鉴定
- 2011年
- 目的构建羊布氏菌超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)基因重组酿酒酵母菌株,并进行鉴定。方法 PCR扩增羊布氏菌16M株SOD基因,与psos载体连接,构建重组表达质粒psos-SOD,转化酿酒酵母菌cdc25H,并进行PCR鉴定、表型验证、自激活及定位情况检验。结果重组真核表达质粒psos-SOD经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌经PCR可扩增出525 bp的SOD基因条带,其表型正常,无自激活宿主菌的作用,表达蛋白定位正确。结论已成功构建了羊布氏菌SOD基因重组酿酒酵母菌株,为研究布氏菌致病的分子机制奠定了基础。
- 王景龙屈海龙杨延玲孙春辉王秀然郎需龙李晓艳卜昭阳王兴龙
- 关键词：超氧化物歧化酶
- 羊布鲁菌16M Omp25真核表达载体的构建被引量：2
- 2013年
- 利用聚合酶链式反应(PCR),以羊布鲁菌16M基因组为模板克隆Omp25基因,设计含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物序列,定向克隆到真核表达载体pCMV-HA上,构建真核表达重组质粒pCMV-HA-Omp25。经测序及双酶切验证正确,证明成功构建了pCMV-HA-Omp25真核表达质粒,为表达纯化外膜蛋白Omp25,研究其功能奠定基础。
- 屈海龙王海浪陈思张瑞王秀然钱晶王兴龙
- 关键词：真核表达
- 羊布鲁菌16M VjbR蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测
- 2013年
- 利用Sos招募系统(SRS),通过PCR扩增羊布鲁菌16M VjbR基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-VjbR,经测序正确后其将转入酵母菌cdc25H(α)感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用。结果表明,经序列测定证实重组诱饵质粒pSos-VjbR构建成功。重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25H(α)酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用。可以利用SRS研究与羊布鲁菌16M VjbR蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究羊布鲁菌致病机制奠定了基础。
- 屈海龙王景龙李晓燕张瑞王秀然陈思钱晶王兴龙
- 关键词：自激活作用酵母双杂交
- 免疫蛋白质组学技术筛选布鲁菌高免疫原性膜蛋白被引量：5
- 2010年
- 目的建立布鲁菌免疫蛋白质组学方法,从羊布鲁菌膜蛋白中筛选免疫候选抗原。方法提取羊布鲁菌16M膜蛋白,进行双向电泳(2-DE)分离,分别用牛、羊布鲁菌感染的阳性血清进行Westernblot分析,筛选出的免疫显性蛋白点进行LC-MS/MS质谱鉴定,并进行生物信息学分析。结果筛选出56个免疫显性蛋白点,鉴定成功35个,其中有12个蛋白是能够被牛、羊2种血清共同识别的抗原。数据检索显示,这些蛋白主要涉及布鲁菌的能量代谢,蛋白质、氨基酸合成,脂肪酸代谢及糖和辅酶的合成等生物过程。结论利用免疫蛋白质组学技术成功筛选出羊布鲁菌高免疫原性膜蛋白,为布鲁菌亚单位疫苗的研制提供了大量的候选抗原。
- 杨艳玲付晓霞盛雪玲王兴龙
- 关键词：布鲁菌蛋白质组学膜蛋白质类免疫印迹法疫苗候选抗原
- 羊布鲁菌强毒株16M与疫苗株M5外膜蛋白蛋白质组学研究被引量：2
- 2010年
- 通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究利用比较蛋白质组学技术,对布鲁菌强毒株16 M和弱毒株M5的外膜蛋白进行了差异比较分析,结果共发现33个差异蛋白点,代表了26个开放阅读框,这些蛋白涉及了蛋白质的生物合成(5/26)、氨基酸合成(3/26),脂肪酸代谢(2/26)、能量代谢(5/26),以及细胞被膜生物合成(4/26)和一些调节系统(4/26)等多个生物过程。这些发现为研究外膜蛋白在布鲁菌毒力,胞内寄生等过程中发挥的重要作用提供了新依据。
- 杨艳玲盛雪玲唐婕郎需龙王景龙卜昭阳王兴龙
- 关键词：外膜蛋白比较蛋白质组学双向电泳
- 羊布鲁菌16M VjbR蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测被引量：1
- 2012年
- 利用Sos招募系统(SRS),通过聚合酶链反应(PCR)扩增羊布鲁菌16M VjbR基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-VjbR,经测序正确后其将转入酵母菌cdc25H(α)感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用。结果表明,经序列测定证实重组诱饵质粒pSos-VjbR构建成功。重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25H(α)酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用。这为利用SRS来研究与羊布鲁菌16MVjbR蛋白相互作用的蛋白奠定了基础。
- 屈海龙王景龙李晓燕张瑞王秀然陈思钱晶王兴龙
- 关键词：自激活作用酵母双杂交
- 羊布鲁氏菌甲酰基转移酶的生物信息学研究
- 2011年
- 本研究旨在分析和预测羊布鲁氏菌甲酰基转移酶基因及其编码蛋白的结构与功能,用于指导其生物学功能的实验室研究。综合利用生物信息学软件(DNAMAN和Vector NTI)、数据库(prosite和PDB)和网络服务器对甲酰基转移酶进行基本性质分析、三维结构预测和功能预测,展示了甲酰基转移酶的氨基酸分布情况,二级结构中形成螺旋、折叠、卷曲的氨基酸区段及结构域;预测并综合阐释了B细胞表位的柔韧性、表面可及性和亲水性参数。生物信息学预测和分析结果可为研究在布鲁氏菌致病及机体免疫应答中甲酰基转移酶的结构与功能的关系提供丰富资料。
- 王景龙王兴龙
- 关键词：甲酰基转移酶生物信息学分析
- 羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达被引量：1
- 2013年
- 目的克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因。方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析。结果扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致;重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4 h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7%,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别。结论成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础。
- 卜昭阳王景龙李晓艳万丽娜郎需龙万忠海孟柯音王兴龙
- 关键词：密度感应系统克隆原核细胞基因表达
