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呼吸道病毒感染患儿外周血淋巴细胞亚群测定及临床意义被引量：5: 2015年; 目的分析呼吸道合胞病毒（humanrespiratorysyncytialvirus，HRSV）、副流感病毒3型（humanparainfluenza virus Ⅲ，HPIV3）和鼻病毒（humanrhinovirus，HRV）感染患儿外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞及NK细胞的变化，并探讨其临床意义。方法病例对照研究。收集2014年2月-2014年11月河北省儿童医院146例急性呼吸道感染患儿标本，应用GeXP多重基因表达系统及RT—PCR扩增技术检测20种常见呼吸道病毒，选择呼吸道合胞病毒感染50例，副流感病毒III型感染46例，鼻病毒感染50例。50名健康儿童作为对照组。采用流式细胞仪检测病毒感染患儿及健康对照组儿童外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和NK细胞值。病毒感染组与正常对照组的比较采用两独立样本比较的Mann-WhitneyU检验，不同病毒感染组间的比较采用多个独立样本比较的Kruskal-WallisH检验。结果HRSV组、HPIV3组和HRV组患儿外周血CD3＋、CD8＋、CD3＋CD4＋CD8＋、CD56＋水平均明显低于健康对照组（PI均分别为〈0．001，〈0．001，〈0．001，和0．002；P2分别为〈0．001，〈0．001，0．002和0．043；P3分别为〈0．001，〈0．001，0．001和〈0．001），CDl9＋水平及CD4＋／CD8＋比值较对照组均显著升高（P1为0．004和〈0．001；P2、P3均〈0．001）。HRSV组和HPIV3组患儿的外周血CD4＋水平较对照组明显升高（P分别为〈0．001和0．001），但HRV组患儿外周血CD4＋水平与对照组相比，差异无统计学意义（P=0．319）；三组病毒感染组分别比较，HRSV组和HRV组CD4＋水平（P=0．034）和CD4＋／CD8＋比值（P=0．018）差异有统计学意义，其他均无统计学意义。结论HRSV、HPIV3及HRV感染均可导致机体细胞免疫功能明显紊乱，且三种病毒感染后外周血淋巴细胞亚群变化趋势一致，均可使病情恶化或病程延长。及时准确的了解病毒感染患儿外周血淋巴细胞亚群的变化能更好�; 冯志山赵梦川李贵霞石仲仁王乐袁晔郭巍巍李军杨硕严小桐马学军; 关键词：呼吸道感染淋巴细胞亚群流式细胞仪

内含中东呼吸综合征冠状病毒部分N基因病毒样颗粒构建和表达被引量：1: 2015年; 目的构建耐RNase酶内含中东呼吸综合征冠状病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）部分N基因的病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）.方法将MS2噬菌体包膜蛋白和成熟酶蛋白基因编码序列插入到表达载体pET32a,构建成pET32MS中间载体,再将MERS-CoV N基因和beta-actin基因片段连接到成熟酶蛋白基因的下游,获得的重组载体p32MS-EMC-Beta转化到E.coli BL21 （DE）感受态细胞中进行诱导表达,表达产物进行纯化,然后进行耐酶实验及稳定性实验.结果获得含MERS-CoV N基因片段的颗粒,可抵抗RNase降解,在37℃保存30d.结论成功构建了含MERS-CoV N基因VLPs且稳定良好,可作为MERS-CoV的标准品和质控品。; 张丹聂凯关丽陆丽马学军; 关键词：噬菌体MS2 冠状病毒属病毒样颗粒

GeXP多重分析技术对四氢叶酸还原酶基因多态性与先天性心脏病相关性的研究被引量：2: 2016年; 目的利用Ge XP多重分析技术,探讨四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)多态性与先天性心脏病相关性。方法收集2013年2月至2014年12月河北省儿童医院心脏外科手术的261例先心病患儿及49例健康对照儿童外周血,提取全血DNA,使用Ge XP多重测序平台的多重分析技术对其MTHFR基因上的两个易感位点rs1801131和rs1801133进行基因分型,采用SPSS 16.0软件的χ2检验,分析先心病与MTHFR基因多态性的相关性。结果 Ge XP多重测序平台可同时测量2个SNP的四种基因型,先心病组与对照组MTHFR677C/T等位基因和基因型频率差异无统计学意义(χ2=0.853,P=0.356;χ2=0.898,P=0.343)。结论 Ge XP多重分析平台是筛查先心病易感基因特异性良好、操作简便的多重分析技术,本研究入选的先心病患儿与健康对照MTHFR等位基因或其基因型分布无显著性差异,为后期大样本量探寻先心病发病易感基因起到启示作用和奠定了方法学基础。; 冯志山赵梦川王乐李贵霞陶曙光温琳琳王琨马学军; 关键词：先天性心脏病亚甲基四氢叶酸还原酶儿童

同时检测六种人类冠状病毒的单管多重RT-PCR方法的建立被引量：9: 2014年; 目的建立一种单管多重RT-PCR检测方法,同时检测6种人类冠状病毒.方法由GenBank获取6种人类冠状病毒（HCoV-NL63、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和MERS-CoV）的核苷酸序列作为参比,分别设计6种冠状病毒保守区靶序列特异性引物,用本实验室所保存的病毒株及核酸样本为模板建立基于全自动电泳仪分析的单管多重RT-PCR检测技术,进行了检测限和重复性评价,并用本实验室所保存的其他呼吸道病毒阳性样品对该方法的特异性进行了再验证.用140份临床样本结合荧光定量RT-PCR法平行验证了该检测方法的可行性.结果基于全自动电泳仪分析的多重RT-PCR检测技术可同时检测6种人类冠状病毒,阳性标本均显示至少一条相应特异性产物预期大小片段（分别为195、304、332、378、415、442 bp）,阴性对照无特异性条带显示,具有较高的特异性.在检测单个病毒时检测限能达到1.0×10^1～ 1.0×10^2拷贝/μl.其他呼吸道病毒验证未发现交叉反应.140份临床样本平行验证结果与常用的单一HCoV检测的荧光定量RT-PCR法一致,阳性样本均为28份（20％）.结论建立的基于全自动电泳分析的单管多重PCR方法能够同时检测6种人类冠状病毒感染,有较高的灵敏度和特异性.; 牛培华张晨陆柔剑王佶楼永良谭文杰马学军; 关键词：冠状病毒属聚合酶链反应

基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增技术检测柯萨奇病毒A6型被引量：3: 2015年; 目的建立基于羟基萘酚蓝（hydroxynaphtholblue，HNB）颜色变化的简单、灵敏和快速的环介导逆转录等温扩增技术（RT—LAMP）检测方法，应用于柯萨奇病毒A6型（coxsackievirusA6，CV-A6）的检测。方法针对CV-A6的VPl基因设计6条特异引物，在等温条件下（63℃）进行50min扩增反应。扩增前在反应体系中加入HNB，通过观察颜色变化进行检测结果判定。使用多种肠道病毒进行特异性验证，使用梯度稀释的体外转录CV-A6全VP1基因RNA进行灵敏度分析，同时与实时荧光定量逆转录PCR（rRT—PCR）检测结果进行比较，并对92份手足口病患者临床标本进行检测。结果本研究建立的RT-LAMP方法对除CV-A6外的23种肠道病毒的检测结果均为阴性，灵敏度为100拷贝／反应，与rRT—PCR方法相当。在对92份手足口病临床标本的检测中，检测结果与rRT-PCR方法相符，Kappa值为1，灵敏度和特异性均为100％。结论本研究建立的针对CV-A6的LAMP检测方法，特异度高，灵敏度与rRT—PCR相当，有望应用于CV—A6感染的快速筛选，具有在基层医疗卫生机构和现场推广与应用的潜力。; 关丽许松涛聂凯张丹李鑫娜许文波马学军; 关键词：聚合酶链反应柯萨奇病毒感染

基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究被引量：1: 2013年; 为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响。结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍;在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2×105倍,尤其是对含有低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显。本研究摸索建立了基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法,能够对样本中低丰度RNA病毒基因组实现有效扩增,可满足开展多种病原体筛查检测的需求。; 庞正李建东李川梁米芳李德新; 关键词：多重置换扩增 RNA病毒

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艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项(2013ZX10004-001)

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