湖南省自然科学基金(08JJ3047)
- 作品数：6 被引量：13H指数：2
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- 携带靶向干扰小鼠早期生长反应基因1短发夹RNA的慢病毒载体转染小鼠视网膜的干扰效率研究
- 2011年
- 目的 构建携带绿色荧光蛋白（GFP）和靶向干扰早期生长反应基因1（Egr-1）短发夹RNA（shRNA）共表达的慢病毒载体,转染小鼠视网膜组织,观察其对Egr-1基因的干扰效率.方法 针对已经筛选确定的Egr-1基因shRNA有效靶序列,构建携带GFP和靶向干扰Egr-1 shRNA的慢病毒载体LV-shRNA（Egr-1）.15日龄C57BL/6小鼠完全随机法分为实验组和阴性对照组,每组10只.LVshRNA（Egr-1）慢病毒载体经玻璃体腔注射转染至实验组小鼠右眼内,不针对任何特异基因的LV-NC 慢病毒载体通过同样的转染途径转染至阴性对照组小鼠右眼内,实验组及阴性对照组小鼠左眼不做任何处理设为空白对照组.2周后荧光显微镜下观察转染情况,实时定量PCR（RQ-PCR）、免疫印迹（Western blot）、免疫荧光检测Egr-1的表达,观察Egr-1基因的干扰效率.结果 慢病毒载体经玻璃体腔注射途径转染小鼠视网膜后,GFP广泛分布于视网膜全层,包括视网膜色素上皮层.与空白对照组和阴性对照组注射眼比较,RQ-PCR检测显示实验组注射眼Egr-1 mRNA表达明显下调（0.290＋0.074比1.006±0.033、1.010±0.086,均P＜0.001）,抑制率为71.29%;免疫印迹显示实验组注射眼内Egr-1蛋白表达明显下调（0.224±0.035比0.674±0.050、0.688±0.049,P＜0.001）,抑制率为67.44%.免疫荧光检测发现实验组注射眼在视网膜除内核层有少许Egr-1阳性细胞分布外,没有荧光表达.结论 成功构建携带绿色荧光蛋白和靶向干扰Egr-1基因shRNA的慢病毒载体,经玻璃体腔注射转染小鼠眼内其转染效率高,分布范围广,且对小鼠视网膜Egr-1基因抑制效率高.
- 蒋晶晶刘双珍文丹王沙
- 关键词：早期生长反应基因1慢病毒载体基因表达调控
- MMP-2与TIMP-2在豚鼠形觉剥夺性近视眼脉络膜表达的变化及调控机制被引量：1
- 2015年
- 目的观察豚鼠形觉剥夺性近视眼脉络膜组织中基质金属蛋白酶(MMP)-2及其特异性组织抑制剂(TIMP-2)表达的变化及其调控机制。方法将42只3周龄的三色豚鼠随机分为A、B、C组,A组为对照组,共12只,将其随机分为A1组和A2组,A1组6只,饲养14 d后处死,A2组6只,饲养21 d后处死;B组为遮盖组,共18只,随机分为B1、B2、B3组,B1组6只,将半透明眼罩缝于右眼遮盖14 d后处死,B2组6只,将半透明眼罩缝于右眼遮盖21 d后处死,B3组6只,将半透明眼罩缝于右眼遮盖14 d后去除遮盖7 d后处死;C组为注药组,随机分为C1、C2组,C1组6只,予右眼球周注射20μl浓度为10-6mmol/L的全反式视黄酸(RA)溶液,C2组6只,予右眼球周注射全反式视黄酸的助溶剂二甲基亚砜(DMSO)溶液作为对照,C1组、C2组均饲养21 d后处死;各组豚鼠左眼不做干预,A1组、B1组、B2组、B3组在饲养14 d后检测眼球屈光度及眼轴长度,A2组、B2组、B3组、C1组、C2组在饲养21 d后检测眼球屈光度及眼轴长度。豚鼠在处死后摘除眼球,对脉络膜组织进行MMP-2和TIMP-2特异性组织抑制剂免疫组化染色,采用免疫组化吸光度测量软件对脉络膜组织阳性着色区进行吸光度测定。结果 B1组右眼在遮盖14 d后眼轴延长,近视形成,脉络膜组织中MMP-2表达增强,与自身左眼、对照组A1组右眼相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。B1组右眼脉络膜组织中TIMP-2染色阳性区灰度值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);B2组右眼在遮盖21 d后眼轴延长,近视形成,脉络膜组织中MMP-2表达增强,与自身左眼、对照组A2组右眼、B1组右眼相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。B2组脉络膜组织中TIMP-2染色阳性区灰度值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);B3组右眼在遮盖14 d后眼轴延长,近视形成,与自身左眼、A1组右眼相比,差异均具有统计学意义(P<0.05),与B2组右眼相比,差异不具有统计学意义(P>0.05);去除
- 吴振凯刘双珍夏晓波毛俊峰许惠卓
- 关键词：MMP-2TIMP-2RA近视
- 豚鼠形觉剥夺性近视眼视网膜Müller细胞中bFGF的表达被引量：2
- 2008年
- 目的观察视网膜Mller细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在豚鼠形觉剥夺性近视(FDM)中的表达,进一步探讨近视眼的发病机制。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠FDM模型;采用玻璃体腔注射L-α-氨基己二酸(L-α-AAA)破坏视网膜Mller细胞,观察其对豚鼠FDM形成的影响。视网膜检影验光测屈光度,A型超声测量眼轴长度。免疫组织化学法观察bFGF在视网膜Mller细胞中的表达。结果遮盖眼与对照眼相比,产生了相对性近视(P<0.05),眼轴增长(P<0.05);去遮盖后,近视度数降低(P<0.05);破坏视网膜Mller细胞后,近视度数较单纯遮盖眼降低(P<0.05)。近视眼与对照眼相比,视网膜Mller细胞中bFGF表达减弱。结论视网膜Mller细胞可能参与了FDM形成的调控;视网膜Mller细胞中bFGF的表达可能与FDM有关。
- 黄瑞尧刘双珍毛俊峰陈果李凤云夏朝华
- 关键词：碱性成纤维细胞生长因子视网膜MÜLLER细胞形觉剥夺性近视
- 卡巴胆碱对人视网膜色素上皮细胞转化生长因子β_2表达的调控
- 2010年
- 目的研究卡巴胆碱对人视网膜色素上皮(RPE)细胞株D407表达转化生长因子β2(TGF-β2)的调控,进而阐明胆碱能药物在近视眼巩膜重塑中的作用。方法常规培养D407细胞,药物干预前换用无血清培养基培养24h。将传代细胞分为实验组和空白组,实验组分别加入1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L卡巴胆碱,空白组不加药物。于处理后2、4、8、16、24、48h分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot法检测细胞中TGF-β2mRNA及TGF-β2蛋白的表达,分析时效与量效关系。结果空白组细胞TGF-β2mRNA、蛋白质表达水平恒定。实验组D407细胞中TGF-β2mRNA的表达随卡巴胆碱作用时间的延长而逐渐升高,差异有统计学意义(F=4455.148,P<0.01);且随卡巴胆碱浓度的升高逐渐增加,各组的总体比较差异有统计学意义(F=1102.240,P<0.01)。卡巴胆碱浓度与干预时间对TGF-β2mRNA表达的影响存在交互作用(F=249.609,P<0.01)。实验组D407细胞中TGF-β2蛋白的表达随时间延长而逐渐升高,各时间点的总体比较差异有统计学意义(F=2619.21,P<0.01),不同浓度卡巴胆碱组TGF-β2蛋白的表达总体比较差异有统计学意义(F=2918.62,P<0.01),卡巴胆碱浓度与干预时相TGF-β2蛋白表达的影响存在交互作用(F=186.02,P<0.01)。结论 RPE细胞可表达TGF-β2,卡巴胆碱可以浓度和时间依赖的方式调控RPE细胞中TGF-β2的表达。
- 谭佳邓志宏刘双珍
- 关键词：视网膜色素上皮细胞卡巴胆碱细胞因子近视
- 血管活性肠肽受体拮抗剂VIPhybrid对鸡形觉剥夺性近视眼发展的影响被引量：10
- 2008年
- 目的:探讨非选择性血管活性肠肽受体(vasoactive intestinal peptide receptors,VIPR)拮抗剂VIPhybrid对雏鸡眼球后壁组织VIP蛋白质和mRNA表达的调控及对雏鸡形觉剥夺性近视眼(form depri-vation myopia,FDM)发生发展的影响。方法:随机选择出生1天龄健康黄色来亨雏鸡共72只,分为6组,每组12只:Ⅰ组单眼遮盖作为空白对照组;Ⅱ组玻璃体腔内注射生理盐水20μL加遮盖作为阴性对照组;Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组分别向玻璃体腔内注射低浓度(3×10-12mol/L)、中浓度(3×10-10mol/L)和高浓度(3×10-8mol/L)VIPhybrid,并加遮盖作为实验组;以上各组均取右眼注射并持续遮盖1周;Ⅵ组双眼均未遮盖、未注射药物作为正常对照组。各组均采用视网膜检影验光检测屈光度,眼科A超测定活体眼轴长度,眼球后壁组织行SP法免疫组织化学染色(每组取7只眼)和RT-PCR的方法(每组取5只眼)分别检测VIP蛋白质和mRNA的表达。结果:遮盖1周后,Ⅰ组、Ⅱ组眼轴延长,形成高度近视眼,组间无统计学差异(P>0.05);Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组近视性屈光度数、眼轴长度明显低于Ⅰ,Ⅱ组(P<0.01),仍高于Ⅵ组(P<0.01);Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组近视性屈光度数、眼轴长度与VIPhybrid浓度呈负相关。VIP在正常视网膜中广泛表达,其中在光感受器外节有强阳性表达;VIP蛋白质和mRNA表达,Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组、Ⅱ组比较明显下调(P<0.01),仍高于Ⅵ组(P<0.01);Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组VIP蛋白质和mR-NA表达随VIPhybrid浓度的升高而下降。结论:FDM中视网膜VIP蛋白质和mRNA表达明显上调;VIPhybrid可有效减缓鸡FDM的发展,下调鸡FDM中视网膜VIP蛋白质和mRNA的表达,可能为人类近视眼的药物治疗提供一条新思路。
- 王平宝王华刘双珍蒋晶晶
- 关键词：形觉剥夺性近视眼血管活性肠肽血管活性肠肽受体拮抗剂
- 阿托品对人视网膜色素上皮细胞D407株表达及分泌TGF-β_2的调控
- 2010年
- 目的:通过观察不同浓度阿托品联合10-5mol/L卡巴胆碱干预下D407细胞表达及分泌TGF-β2的变化,探讨阿托品对RPE细胞表达及分泌TGF-β2的调控作用。方法:常规培养D407细胞,药物干预前换用无血清培养基培养,分为4组。(1)实验组(A组):A1～A5组依次加入10-4～10-8mol/L阿托品,孵育30 min后每组加入10-5mol/L卡巴胆碱;(2)阴性对照组(B组):B1～B5组依次加入10-4～10-8mol/L阿托品;(3)阳性对照组(C组):加入10-5mol/L卡巴胆碱;(4)空白对照组(D组):不加药物。干预24 h后采用RT-PCR,Western印迹及ELISA法检测细胞胞浆中TGF-β2mRNA及蛋白质的表达水平及上清液中TGF-β2的含量。统计学方法采用单因素方差分析。结果:实验组D407细胞胞浆TGF-β2mRNA和蛋白质表达水平及上清中TGF-β2蛋白质含量均较阳性对照组低,10-4mol/L阿托品可完全阻断10-5mol/L卡巴胆碱上调TGF-β2表达及分泌的作用,其效应具有浓度依赖性(F=1 056.897,1 320.170,475.657;P<0.001)。阴性对照组D407细胞胞浆TGF-β2mRNA和蛋白质表达水平及上清中TGF-β2蛋白质含量与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:阿托品可有效抑制卡巴胆碱促进人RPE细胞表达及分泌TGF-β2的功能,提示M受体参与介导此过程。
- 谭佳邓志宏刘双珍
- 关键词：视网膜色素上皮转化生长因子Β2卡巴胆碱阿托品
