安徽省高校省级自然科学研究项目(KJ2007A017)
- 作品数：12 被引量：20H指数：3
- 相关作者：张部昌黄训端赵皓刘道琴袁华更多>>
- 相关机构：安徽大学安徽文达信息技术职业学院军事医学科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金安徽省高校省级自然科学研究项目安徽省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程医药卫生更多>>
- 红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK的克隆及原核表达
- 2008年
- 目的:探讨红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法:将eryK基因克隆到表达质粒pET-22b(+),使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并对装液量、接种量、诱导时间、IPTG浓度和FeC l3浓度等表达条件进行优化。结果与结论:SDS-PAGE电泳显示,在相对分子质量44×103处有EryK蛋白条带,其含量占菌体总蛋白的58%以上。证明高GC含量的红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因EryK可以在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达,为体外研究EryK酶学相关性质以及大规模发酵奠定了基础。
- 赵皓黄训端张部昌孔小卫张书祥查向东
- 关键词：红色糖多孢菌
- 红色糖多孢菌M合成3-脱氧-3-羰基-赤酮酸内酯B的限速因子研究
- 2010年
- 目的探讨红色糖多孢菌KR6基因突变体生物合成3-脱氧-3羰基-赤酮酸内酯B(DOEB)产量显著降低的原因。方法以KR6基因突变体M菌株为研究对象,采用相对实时荧光定量RT-PCR技术、抗原-抗体检测技术和高分辨LC-MS分析技术等,分别从基因的转录水平、翻译水平以及聚酮化合物水平等层面研究了DOEB的生物合成量。结果红色糖多孢菌M菌株与出发菌株A226相比,两者聚酮合酶(PKS)基因簇在转录水平和翻译水平上的表达差异均非造成DOEB产量降低的限速因子;而DOEB的前体转化能力却大幅度降低,因此,DOEB合酶的活力降低是造成生物合成DOEB产量降低的关键因素。结论 DOEB合酶的活力是生物合成DOEB的限速因子,本研究为进一步探讨利用基因工程途径提高新酮内酯类化合物产量奠定了基础。
- 马树梅黄训端王永中刘道琴刘惠曹诚陈惠鹏张部昌
- 红色糖多孢菌染色体基因快速失活技术研究及应用被引量：2
- 2009年
- 目的:研究红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术。方法:以Thio抗性基因(tsr)作为筛选标记,在其上下游分别连接失活目的基因两侧同源片段,利用PEG介导原生质体转化将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌,通过tsr基因两侧同源片段与染色体同时重组,将目的基因敲除或失活。结果:tsr基因两侧同源片段长度与红色糖多孢菌染色体同源重组效率密切相关,同源片段长度在500 bp左右时,线性片段与染色体有效重组率很低,而同源片段长度超过1000 bp时,可获得有效的基因失活突变菌株。通过这种技术构建的红色糖多孢菌ΔbldD基因突变体,合成红霉素产量显著降低,说明bldD参与红霉素合成基因调控。结论:红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术,对于分析红色糖多孢菌基因功能具有重要作用。
- 刘惠黄训端刘道琴赵玮樊伟韩姝张部昌
- 关键词：红色糖多孢菌同源重组
- 红霉素类药物基因工程被引量：7
- 2009年
- 红霉素类药物在临床上应用广泛，已通过化学修饰发展到第三代红霉素。红霉素基因工程发展迅速．不仅合成了100多种红霉素结构类似物．而且在提高红霉素产量方面也取得了重要进展，下面重点介绍红霉素类药物基因工程研究概况，特别对合成新的红霉素类似物和提高红霉素产量进行了阐述。
- 张部昌黄训端
- 关键词：红霉素糖多孢红霉菌基因工程
- 红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体的构建及产物分析被引量：1
- 2010年
- 目的构建红色糖多孢菌糖基转移酶EryCⅢ失活突变体,为探索红霉素糖基结构修饰和合成新型红霉素衍生物打下基础。方法通过PCR扩增方法将eryCⅢ基因缺失130bp后,克隆至同源重组型质粒pWHM3上,构建pWHM3-ΔeryCⅢ,将其导入红色糖多孢菌A226中。经过两次同源重组,筛选出1株缺失EryCⅢ酶活性的红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体。使用抑菌实验、薄层层析和质谱对其发酵产物进行分析,并通过回补实验进一步验证。结果与结论对红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ染色体序列测定表明,eryCⅢ基因相应位点缺失130bp,突变菌株发酵产物对枯草芽孢杆菌无抑制作用,薄层和质谱结果表明突变菌株积累3-L-mycarose红霉内酯B(MEB),而并没有发现红霉素产物。回补验证发现eryCⅢ基因导入A226-ΔeryCⅢ使得其恢复了红霉素合成能力。所构建的红色糖多孢菌EryCⅢ失活突变体A226-ΔeryCⅢ,为探讨组合合成红霉素衍生物奠定基础。
- 许晓娟黄训端赵玮郭金华陈惠鹏曹诚张部昌
- 关键词：红色糖多孢菌糖基转移酶同源重组红霉素
- bldD基因过量表达对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响被引量：5
- 2010年
- 目的通过增加红色糖多孢菌调控基因bldD拷贝,获得红霉素高产菌株,并探讨bldD基因过量表达对红色糖多孢菌形态分化的影响。方法以红色糖多孢菌A226为出发菌株,通过染色体同源重组方法获得红色糖多孢菌A226bldD基因失活突变菌株A226-△bldD。将bldD基因表达质粒pZMW-bldD分别导入突变株A226-△bldD及出发菌株A226中,获得A226-△bldD/bldD菌株和A226/bldD菌株,利用TLC法和HPLC法对其发酵产物进行分析,并观察孢子生长状况。结果红色糖多孢菌A226中bldD基因失活后产红霉素水平明显降低,不能形成孢子;bldD基因的回复表达使A226-△bldD突变菌株产红霉素能力得到恢复,且孢子形成恢复正常;在红色糖多孢菌A226中过量表达bldD基因可提高红霉素产量,较出发菌株A226提高20%,同时可使孢子形成时间提前。结论在红色糖多孢菌中过量表达bldD基因,可获得红霉素高产菌株,同时会影响红色糖多孢菌形态分化进程。
- 何晶晶黄训端宋平郭金华陈惠鹏曹诚张部昌
- 关键词：红色糖多孢菌红霉素形态分化基因表达
- 红霉素3"-O-甲基转移酶基因eryG克隆及表达被引量：1
- 2008年
- 目的:探索红色糖多孢菌红霉素eryG基因在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法:以红色糖多孢菌总DNA为模板,PCR扩增出eryG基因序列,克隆到原核表达载体pET-22b(+)上,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。从诱导剂IPTG的终浓度和诱导时间两个因素来优化eryG基因的表达条件。结果:eryG基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物EryG经SDS-PAGE分析相对分子质量约为33×103。表达条件经优化后,重组蛋白EryG表达量占菌体总蛋白的55%以上。结论:红色糖多孢菌红霉素eryG基因可以在大肠杆菌中高效地表达,为进一步研究EryG的相关酶学性质、分析其对红霉素发酵产物的影响奠定了基础。
- 袁华张部昌赵皓孔小卫黄训端查向东张书祥
- 关键词：红色糖多孢菌红霉素
- 产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G^-突变体的构建被引量：4
- 2008年
- 糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3"-O-甲基转移酶(EryG),失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成,积累其中间产物红霉素C。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版,用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bp DNA片段(ΔG),其中去除了EryG上S-腺苷甲硫氨酸结合区域对应的290bp DNA片段。将该片段克隆于质粒pWHM3,构建了同源重组质粒pWHMΔG。PEG介导原生质体转化法将pWHMΔG转入糖多孢红霉菌A226中,通过染色体同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体,此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿,糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢复红霉素A的合成能力。
- 袁华黄训端张部昌刘道琴赵皓孔小卫张书祥
- 关键词：糖多孢红霉菌红霉素同源重组
- 产红霉素B红色糖多孢菌突变体的构建(英文)被引量：1
- 2009年
- 目的:获得大量红霉素合成中间产物红霉素B,并进一步研究eryK基因的活性位点。方法:通过重叠PCR将eryK基因中包括BC环在内的关键氨基酸序列删除,克隆到同源重组质粒pWHM3上,继而通过染色体同源重组方法将EryK羟基化酶基因失活,构建了缺失C-12羟基化酶活性的红色糖多孢菌突变体。结果与结论:构建了红色糖多孢菌突变菌株AK17,对发酵产物进行TLC和MS分析,结果显示突变体主要合成红霉素B。
- 赵皓董翔张部昌袁华黄训端张书祥
- 红色糖多孢菌表达载体pZW的构建
- 2007年
- 目的:对红色糖多孢菌染色体整合型表达载体pZMW进行改进,以提高表达载体稳定性和表达外源基因效率。方法:以pSET152和pET-22b(+)为出发质粒,用PCR方法从红色糖多孢菌染色体DNA上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了红色糖多孢菌表达载体pZW。结果:与pZMW相比,pZW表达载体只有1个大肠杆菌质粒复制子,质粒减小2 530 bp,同时在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中能够表达硫链丝菌肽抗性基因(thio)和荧光蛋白基因(EGFP)。结论:pZW质粒能够在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中稳定表达外源基因。
- 魏魏张部昌袁华赵皓彭惠
- 关键词：红色糖多孢菌红霉素
