江西省科技支撑计划项目(20132BBF60044)
- 作品数：6 被引量：17H指数：2
- 相关作者：邓舜洲林敏刘小兰刘小兰邹柳更多>>
- 相关机构：江西农业大学江西省动物疫病预防控制中心更多>>
- 发文基金：江西省科技支撑计划项目国家现代农业产业技术体系建设项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 猪痘病毒TK、ORF121、ORF143基因缺失毒株的 构建及其生物学特性的测定被引量：3
- 2020年
- 为筛选猪痘病毒(SWPV)复制非必需区并测定其缺失株的生物学特性,本研究根据同源重组原理分别针对SWPV的TK(ORF063)、ORF 121和ORF 143基因设计引物。应用重叠延伸PCR技术拼接同源重组左右臂及EGFP筛选标记表达盒,将拼接片段分别转染到感染SWPV的PK15细胞。利用荧光显微镜观察标记含EGFP的单个蚀斑,筛选获取重组毒株。应用PCR及Western blotting对重组毒株进行鉴定。分别测定各毒株感染PK15细胞的蚀斑大小和皮下接种保育猪致病性。PCR结果表明,目的基因成功整合到相应位点,成功获得重组毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting结果显示,连续传代的重组毒株在PK15细胞上稳定表达外源蛋白。重组毒株在PK15细胞上形成的痘斑均小于亲本毒株,其中ORF121缺失株差异极显著(P<0.01)。各毒株均可导致保育猪痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病变时间短,产生痘斑小,毒力较亲本下降。综上所述,本研究筛选到2个SWPV基因组中可供外源蛋白插入的复制非必需区ORF121和ORF143,为构建SWPV基因工程载体奠定了基础。
- 刘昌锦邓舜洲罗锋钟罗华王喆高映雪刘小兰
- 关键词：重叠延伸PCR生物学特性
- 鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定被引量：1
- 2020年
- 为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒(FWPV)株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞(CEF)和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为(258~344)nm×(153~238)nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV(登录号:NC_002188.1)核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。
- 高映雪林敏胡换仪刘小兰刘昌锦万文忠罗锋邓舜洲
- 关键词：病毒粒子
- 2013～2018年江西省猪伪狂犬病病毒流行株gE和gB基因遗传变异分析被引量：10
- 2020年
- 为掌握江西省猪伪狂犬病病毒(PRV)的分子流行病学及遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2018年采集自江西南昌、宜春、赣州、吉安、九江、上饶、抚州、新余8个地区的PRV阳性猪病料进行gE和gB基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,共获得64株PRV的gE基因序列和12株PRV的gB基因序列;gE基因遗传进化树表明,64株PRV同属一个大分支,与亚洲毒株及近年来国内分离株亲缘关系较近,全部为GⅠ型,而与GⅡ型的欧美经典毒株亲缘关系较远;江西毒株gE基因与19株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%~100%和94.6%~100%;gB基因与11株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.2%~100%和96.5%~100%;相较于Bartha-K61疫苗株,江西流行毒株的gB基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了江西省PRV的流行与变异情况,为江西省科学防控PRV提供理论依据。
- 高映雪蒋新华周荷田罗锋杨丹凤万文忠邓舜洲
- 关键词：GE基因GB基因
- 猪痘病毒江西分离株全基因组测序及其复制非必需区的筛选
- 猪痘(Swinepox,SWP)是由猪痘病毒(Swinepox Virus,SWPV)引起猪的一种以皮肤损伤、形成痘疹和结痂为特征的猪传染病,病猪能自行康复,对养猪业造成的损失极小。猪痘病毒具有严格的宿主特异性(在自然状...
- 罗锋
- 关键词：全基因组测序融合PCR生物学特性
- 文献传递
- 胞内劳森菌LS1087和LS1136蛋白的表达及其单克隆抗体的制备及应用
- 猪回肠炎(全称猪增生性回肠炎porcine proliferative enteropathy,PPE)是由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的一种以回肠及盲肠结处近端的结肠、盲肠黏...
- 曹亮亮
- 关键词：原核表达单克隆抗体
- 文献传递
- 表达猪圆环2型的多拷贝P28-Cap重组猪痘病毒的构建及表达量分析被引量：2
- 2021年
- 为探究猪痘病毒作为载体表达猪圆环病毒2型(PCV2)-Cap蛋白,插入外源基因P28-ORF2的拷贝数与PCV2-Cap蛋白表达量的关系。本试验以猪痘病毒为载体,通过双酶切连接及无缝克隆方法构建重组质粒,并纯化到了8株含不同拷贝数(1~8拷贝)P28-ORF2的重组猪痘病毒,基于荧光斑大小、电镜观察病毒粒子及Western blotting结果进行判断。纯化到的8株重组病毒的荧光斑直径为317.41~384.96μm,大小无明显差异。重组猪痘病毒粒子形态与亲本病毒一致。Western blotting结果为插入1拷贝P28-ORF2的重组蛋白表达量最低;随着P28-ORF2拷贝数的增加,PCV2-Cap表达量也随之增加;至插入4拷贝P28-ORF2时,PCV2-Cap表达量达到峰值;随后减少。8株重组猪痘病毒荧光斑大小无明显差异,表明猪痘病毒基因组中插入不同拷贝数P28-ORF2对重组病毒在PK15细胞内的增殖无影响。重组猪痘病毒粒子的形态未发生变化说明多拷贝外源基因的插入并未对猪痘病毒的结构造成影响。本研究结果表明,猪痘病毒为载体表达外源蛋白时,单启动子启动多拷贝外源序列能明显提高外源蛋白的表达量,插入4拷贝的外源序列为较合适的拷贝数。
- 高映雪薛瑞林敏胡换仪刘昌锦万文忠罗锋邓舜洲
- 关键词：猪圆环病毒2型拷贝数
- 猪痘病毒江西分离株JX08的分离鉴定
- 2014年
- 采用PK15细胞培养,对江西省某猪场疑似猪痘的病猪皮肤丘疹进行病毒分离,分离到1株猪痘病毒,命名为SWPV JX08,。根据猪痘病毒基因组序列设计了5对引物,对分离毒株进行TK基因、P35基因、P23基因、TK基因上游和下游片段分别进行PCR扩增,扩增片段与GenBank收录的猪痘病毒（AF410153.1）的核苷酸序列的同源性分别为97.5%、98%、98.6%、98.2%和98%。该分离毒株不但能使PK15细胞产生稳定的细胞病变,还能适应非猪源性的Vero细胞,并产生细胞病变;电镜下可见感染的PK15细胞内形成椭圆形或圆形的包涵体,胞浆中有大量椭圆形、砖形的典型猪痘病毒粒子,病毒粒子中央为哑铃状芯髓,病毒粒子大小为（244~340）nm×（164~263）nm。该毒株皮下或静脉接种25日龄仔猪,感染7~11d后,表现典型猪痘的症状（皮肤出现丘疹）,其血清中可检测到SWPV抗体。
- 邓舜洲徐昌满张文波蒋新华邹柳冷闯胡杨朱芝秀
- 胞内劳森菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用被引量：2
- 2022年
- 为建立用于检测临床粪便样品中胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究参考GenBank中发表的L.intracellularis PHE/MN1-00株基因组序列设计50对引物,通过SYBR GreenⅠ荧光染料法PCR验证引物的特异性,针对扩增效率最好的特异性上、下游引物合成相应的TaqMan探针,优化反应条件,对其线性范围、敏感性和重复性进行验证,系统的完成了该方法的建立。结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR方法,特异性强;在靶标核酸为2.95×10^(1)~2.95×10^(6)拷贝/μL区间线性关系良好,相关系数R^(2)=0.9981,扩增效率为96.51%;最低检测浓度为5拷贝/μL;批间和批内的CV均小于2%,重复性好。使用普通PCR方法与本方法对2020年10月至2021年2月采自江西地区猪场的373份粪便样品进行检测,L.intracellularis的总检出率分别为21.4%(80/373)和27.6%(103/373),显示本方法具有更高的敏感性,其检测场阳性率为88.9%(8/9),各阶段生产猪群阳性率分别为经产母猪28.7%、保育仔猪36.4%和育肥猪14.3%。该检测结果为江西地区的L.intracellularis的流行情况提供参考。
- 刘昌锦魏黄思梧胡换仪肖童林敏刘小兰边彦超罗峰邓舜洲
