国家高技术研究发展计划(2012AA020805)
- 作品数：9 被引量：14H指数：2
- 相关作者：饶春明李永红付志浩高凯于雷更多>>
- 相关机构：中国食品药品检定研究院中国生物技术集团公司武汉生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学理学更多>>
- 实时荧光定量PCR法用于重组猿免疫缺损病毒-人色素上皮衍生因子注射液中复制型SIV的检测
- 2014年
- 目的:建立重组猿免疫缺损病毒-人色素上皮衍生因子(simian immunodeficiency virus-human pigment epithelium-derived factor,SIV-hPEDF)注射液中复制型SIV的实时定量PCR检测方法。方法:在提取重组SIV-hPEDF注射液供试品基因组RNA后,采用实时定量PCR的方法,检测供试品中的复制型SIV。结果:经过3次实验,所得TAT RNA标准品标准曲线均线性良好,线性方程为Y=-3.248lgX+38.12,相关系数为0.994;重组SIV-hPEDF注射液供试品中复制型SIV检测结果均为阴性。结论:所建立的复制型SIV实时荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏、准确,可用于重组SIV-hPEDF注射液中复制型SIV的检测。
- 秦玺李永红杨琦杨靖清于雷杨玉帅徐莉饶春明
- 关键词：基因治疗药物
- 重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体质控方法与质量标准的建立
- 2016年
- 目的建立重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的质控方法和质量标准。方法利用乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制试验测定重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的生物学活性;RP-HPLC和SECHPLC测定其纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;荧光定量PCR检测E.coli宿主DNA残留量;ELISA法测定宿主蛋白残留量;Edman降解法进行N-末端序列测定;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按《中国药典》三部(2010版)规定进行。同时对通常在原液中进行检定的宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定进行初步的方法验证,考察其在成品中进行检测的可行性。结果经初步验证,在成品中进行宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定具有可行性,用建立的方法对重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。同时只对成品进行质控的方法和质量标准对同类产品的质量控制具有借鉴意义。
- 毕华李永红杨靖清丁有学范文红韩春梅李响史新昌裴德宁饶春明
- 关键词：生物学活性
- 柱前衍生反相高效液相色谱法测定猴免疫缺陷病毒基因治疗产品中盐酸组氨酸含量被引量：1
- 2014年
- 目的建立柱前衍生反相高效液相色谱法（reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC）测定猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）基因治疗产品中盐酸组氨酸含量的方法。方法以正亮氨酸为内标,异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate,PITC）为柱前衍生化试剂,采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm,5μm）色谱柱,以醋酸钠缓冲液（pH 6.5）和80%乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,检测波长254 nm,进样量10μl,流速1.0 ml/min。用建立的方法检测样品中盐酸组氨酸含量,绘制标准曲线,并验证该方法的精密度、稳定性、专属性和准确性。结果盐酸组氨酸在12.54-31.35μg范围内,进样量与峰面积呈良好的线性关系（r2=0.999 9）;3份供试品溶液,每份连续进样5次,盐酸组氨酸峰面积平均RSD值为1.77%;同1份供试品溶液0、3、6、12 h进样,盐酸组氨酸峰面积平均RSD值为1.03%;该方法可将甘氨酸、精氨酸和丝氨酸对照品有效分离;高、中、低浓度样品的平均回收率分别为103.37%、102.28%和102.91%。SIV基因治疗产品中盐酸组氨酸3次检测的平均含量为9.66 mg/ml。结论建立了柱前衍生RP-HPLC检测SIV基因治疗产品中盐酸组氨酸含量的方法,该方法重现性好,专属性强,精密度及准确度高,可对基因治疗产品中的盐酸组氨酸进行质量控制。
- 秦玺李响杨琦于雷付志浩李永红饶春明
- 关键词：柱前衍生化
- 细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证被引量：1
- 2014年
- 目的 建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR Green玉实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法 以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR Green玉实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus,MMLV）逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果1组引物（上游：5忆-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3忆,下游：5忆-TCCTGCTC-AACTTCCTGTCGAG-3忆）更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108～5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数（CV）为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论 建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR Green玉实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。
- 王晨李永红付志浩张爱华饶春明
- 关键词：细胞株逆转录酶活性实时定量PCR
- 首批逆转录酶活性测定国家标准品的研制被引量：1
- 2016年
- 目的 研制首批逆转录酶活性测定国家标准品。方法 按《中国药典》2015年版三部相关要求,进行逆转录酶活性测定标准品的制备、检验,并使用热加速试验进行稳定性考察,以SYBR GreenⅠ实时定量聚合酶链式反应法分别在4个实验室进行协作标定。结果 制备的逆转录酶活性测定标准品外观、无菌检查合格,水分含量为1.3%,分装精度为0.75%。在-20、4、25和37℃放置3个月和6个月的标准品与-70℃保存的标准品相比酶活性均没有下降。经4个实验室协作标定共22次,标准品酶活性的几何平均值为每支26 U,95%置信区间为每支22.95~30.45 U。结论 该批逆转录酶活性测定标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,酶活性定为每支26 U。
- 李永红王晨付志浩郭莹韩春梅饶春明
- 关键词：逆转录酶国家标准品酶活性
- 仙台病毒载体的研究与应用进展被引量：2
- 2016年
- 仙台病毒(Sendai virus,Se V)属于副粘病毒科呼吸道病毒属,基因组为不分节段的单负链RNA,编码NP,P,M,F,HN,L等11个蛋白。应用反向遗传学构建的仙台病毒载体是新兴的RNA病毒载体,由于其宿主范围广、表达量高、胞质表达、安全性好等诸多优点,目前广泛用于基因治疗药物和疫苗研究。本文从仙台病毒的基因组分子结构、致病性和免疫原性、载体的构建和类型以及其应用等方面进行详细论述。
- 付志浩李永红高凯饶春明王军志
- 关键词：仙台病毒反向遗传学基因治疗疫苗
- 中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品的研制被引量：8
- 2013年
- 目的建立中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量定量测定用国家标准品。方法使用QIAGEN Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备了中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA作为标准品原料,通过紫外分光光度法和电泳进行纯度和含量测定后分装,采用紫外分光光度法对我国第一批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品进行协作标定,并评价其稳定性和适用性。结果中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品经检测,A260/A280均在1.7～1.9之间,电泳图谱只有单一条带,符合规定。该标准品经6家实验室协作标定共90次,几何平均含量为93.63μg.mL-1,平均含量的95%可信区间为92.86～94.40μg.mL-1,单次测定的95%参考值范围为86.51～100.89μg.mL-1,平均可信限率为0.81%。加速热稳定实验表明,该标准品在-20、4、25、37℃条件下放置4个月,DNA含量无明显改变,但37℃条件下A260/A280有下降趋势;-20、4、25℃条件下电泳结果为单一条带,37℃条件下DNA有降解条带。-20℃贮存1年的长期稳定性结果显示,标准品DNA浓度及A260/A280无显著性差异,电泳条带单一,因此-20℃条件下长期保存标准品稳定性较好。在标准品适用性研究中,利用该标准品进行荧光染色法测定,标准曲线r值为0.999 0以上,在0.781～100 ng.mL-1之间线性良好,各稀释度RSD均小于10%;利用该标准品进行定量PCR法测定,标准曲线r值为0.990 0以上,在10-2～103pg之间线性良好,熔解曲线可见单一峰出现。结论该批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于荧光染色法和定量PCR检测中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量,含量定为93.63μg.mL-1,批号为270026-201101。
- 王兰高凯范文红毕华付志浩李永红饶春明
- 关键词：国家标准品荧光染色法
- 重组2型腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因治疗制剂的质量分析被引量：1
- 2015年
- 目的对重组2型腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(recombinant adeno-associated virus 2 encoding tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand,r AAV2-TRAIL)基因治疗制剂进行质量分析,并针对其关键质量属性建立质控方法。方法采用PCR法对r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中插入的启动子CAG和目的基因TRAIL进行鉴别;在腺病毒(Ad5)的辅助下,将r AAV2-TRAIL体外感染293T细胞后,采用ELISA法检测培养上清中目的蛋白TRAIL的表达量,检测r AAV2-TRAIL对神经胶质瘤U251细胞的体外杀伤活性;设计引物及探针,采用Q-PCR法检测r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中的r AAV2-TRAIL滴度、可能存在的复制型rc AAV滴度以及残余辅助病毒1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV1)滴度。结果启动子CAG和目的基因TRAIL的PCR鉴定结果与理论及理化对照品相符;r AAV2-TRAIL感染293T细胞48 h后,上清中TRAIL表达量为(0.36±0.18)ng/ml,RSD为50.0%;r AAV2-TRAIL体外作用于神经胶质瘤细胞U251,细胞生长相对抑制率为(26.6±3.75)%,RSD为14.1%;制剂中r AAV2-TRAIL滴度为(4.72×1011±0.52×1011)copies/ml,RSD为11.0%,rc AAV滴度为(2.49×107±0.18×107)copies/ml,RSD为7.2%,HSV1滴度为(6.02×106±0.51×106)copies/ml,RSD为8.5%。r AAV2-TRAIL/rc AAV为1.90×104,r AAV2-TRAIL/HSV1为7.84×104。结论建立的质控方法可用于r AAV2-TRAIL的质量控制,为该产品质量标准的建立奠定了基础,同时对以AAV为载体的基因治疗制剂的质量研究提供参考。
- 付志浩高凯李永红李响陶磊王兰丁有学郭莹饶春明
- 关键词：腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因治疗
- 实时荧光定量PCR法用于重组SIV-hPEDF注射液病毒颗粒数的检测被引量：1
- 2015年
- 目的:建立重组SIV-h PEDF注射液病毒颗粒数检测实时定量PCR检测方法。方法:在提取重组SIV-h PEDF注射液供试品基因组RNA后,采用实时定量PCR的方法,检测供试品中的病毒颗粒数。结果:经过3次实验,所得SIV-h PEDF RNA标准品标准曲线均线性良好,重组SIV-h PEDF注射液供试品中病毒颗粒数检测结果无显著性差异。结论:所建立的重组SIV-h PEDF注射液病毒颗粒数实时荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏、准确,可用于重组SIV-h PEDF注射液病毒颗粒数的检测。
- 秦玺李永红杨琦杨靖清于雷杨玉帅徐莉饶春明
- 关键词：实时定量PCR
