吉林省自然科学基金(201015204)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 殊异韦荣菌苹果酸脱氢酶的基因克隆及其重组蛋白的表达和活性测定
- 2013年
- 目的:对殊异韦荣菌(V·dispar)苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因进行克隆和重组表达,并对其重组蛋白进行纯化和活性测定。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,PCR扩增MDH同源区序列片段,克隆入pET-28a载体并转化至大肠杆菌DH5α,酶切及PCR鉴定,测序。将重组质粒转入BL21(DE3)中,选择最佳表达条件,提纯及测定活性。结果:PCR扩增产物特异,全长1139bp。测序结果包含MDH基因,并与GenBank中所报道的大肠杆菌MDH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。MDH纯化后的蛋白活性值为0.4403U/mL。结论:成功克隆殊异韦荣菌MDH基因,并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架。还获得了重组表达MDH蛋白的最适表达条件,并测出韦荣菌苹果酸脱氢酶的活性。
- 刘晓红何钟勤孙晓宇高心薛莹李倪娜
- 关键词：苹果酸脱氢酶基因克隆活性测定
- 殊异韦荣菌sahH基因的克隆、表达和纯化
- 2013年
- 目的:对殊异韦荣菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(sahH)基因进行克隆、鉴定、表达和纯化,为研究龋病的微生物致病机制提供理论依据。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,采用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒,转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中,酶切、PCR鉴定和测序后,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果:PCR扩增产物全长为1 410bp。测序结果经BLAST软件分析,与GenBank中所报道的绿脓假单胞菌sahH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。该基因序列已登陆GenBank,序列号为KC477409。SDS-PAGE分析,重组质粒在E.coli JM109中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为50 000,诱导5h蛋白表达量最高,浓缩后蛋白浓度为5.4g.L-1。Western blotting法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。结论:成功克隆了殊异韦荣菌sahH基因,并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白。
- 孙晓宇何钟勤刘晓红高心钟丞薛莹
- 关键词：基因克隆基因表达纯化
