国家自然科学基金(30571697)
- 作品数：20 被引量：42H指数：4
- 相关作者：马远方李淑莲刘广超杜耀武王靖更多>>
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- DR5胞外段基因的表达及功能初步鉴定被引量：1
- 2007年
- 目的:获得具有生物活性的人DR5胞外段蛋白。方法:通过RT-PCR从Jurkat细胞中钓取DR5的胞外段基因(55-183位氨基酸),克隆到pGEM(-T Easy载体中,经核酸序列测定正确后,将其再次克隆入原核表达载体pET30 a中,在E.coliBL21(DE3)实现蛋白表达。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。ELISA法分析其与抗DR5单克隆抗体(mAb)结合能力。结果:克隆到人DR5基因的胞外段基因,测序结果和报道的一致;构建了人DR5胞外段基因的原核表达载体并实现在E.coliBL21(DE3)中大量表达;SDS-PAGE表明所表达蛋白与预期蛋白的相对分子质量(Mr)一致;Western blot及ELISA的结果表明该蛋白能与抗DR5抗体反应,竞争阻断试验表明DR5胞外段可阻断TRAIL对Jurkat细胞生长的抑制。结论:成功地制备了具有生物活性的DR5胞外区,为后续研究打下了基础。
- 陈居杲王玉刚赵昆朋谷欣黎燕马远方沈倍奋
- 关键词：RT-PCR原核表达
- 抗DR5单抗增强顺铂诱导HeLa细胞凋亡作用的研究被引量：4
- 2007年
- 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)主要通过死亡受体5(death recep- tor,DR5)诱导肿瘤细胞凋亡。本文旨在探讨顺铂对HeLa细胞表面DR5分子表达影响及抗DR5单抗mDRA-6对顺铂诱导HeLa细胞凋亡增强作用。用间接免疫荧光染色结合流式细胞术分析DR5分子表达;MTT法检测HeLa细胞毒作用;用AnnexinV/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率;荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学改变。结果:正常HeLa细胞表面DR5表达量为30.01%,顺铂不能上调HeLa细胞表面DR5表达;mDRA-6可以明显提高顺铂对HeLa细胞的细胞毒作用,且存在剂量效应关系。IC_(50)值约为12.5μg/ml。研究结果表明,mDRA-6能够明显增强顺铂对HeLa细胞的细胞毒及细胞凋亡作用。
- 赵粤萍贾彩云马远方沈倍奋
- 关键词：MDRA-6DR5顺铂细胞毒凋亡
- 抗hDR5单抗对食管癌细胞的凋亡及CDC作用观察
- 2008年
- 目的:观察抗hDR5单抗对食管癌细胞的凋亡作用及CDC作用。方法:采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用MTT法及显微摄影观察McAb及补体作用后EC109的增殖及形态变化,流式细胞仪观察细胞凋亡。结果:获得了单克隆抗体,其对EC109的凋亡诱导作用呈剂量依赖性;与对照组比较,补体可显著提高单抗对EC109的细胞毒作用,二者联用其细胞生长抑制率可达83.04%,形态学观察可见凋亡小体及细胞溶解;结论:DR5单抗具有诱导EC109细胞凋亡的作用,与补体联合应用具有较强的CDC效应。
- 黄红莹杜耀武白慧玲李淑莲马远方
- 关键词：DR5单克隆抗体
- 抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞凋亡的作用被引量：1
- 2008年
- 目的:研究鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对白血病细胞U937的凋亡诱导作用。方法:光镜下观察mDRA-6作用后U937细胞的形态变化;流式细胞术检测U937细胞表面DR5表达率;MTT法检测mDRA-6对U937细胞生长的影响;An-nexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳检测U937细胞DNA的片段化降解;JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变。结果:mDRA-6作用U937细胞后呈现典型的细胞凋亡特征;MTT法检测显示mDRA-6作用U937细胞24小时死亡率为61·09%,并呈时间、浓度依赖性;流式细胞仪检测显示10mg/L的mDRA-6作用4小时,U937细胞凋亡率为79·12%;琼脂糖凝胶电泳显示DNA呈现明显梯状带型;mDRA-6作用U937细胞后线粒体膜电位明显下降。结论:mDRA-6能够诱导白血病U937细胞凋亡,是具有诱导细胞凋亡活性的功能性抗体。
- 王靖李淑莲马远方刘广超杜耀武王雪银
- 关键词：DR5单克隆抗体白血病细胞凋亡
- 平顶猴TRIM5α基因变异影响其抗HIV-1功能
- 2008年
- 目的:解释平顶猴成为唯一能够被HIV-1感染的旧大陆猴以及在被SIV感染时出现较其他旧大陆猴严重临床症状的原因。方法:参考人TRIM5α基因的结构和序列合成引物,以平顶猴DNA为模板,分别扩增其TRIM5α基因编码序列的所有外显子。利用生物学软件分析获得的编码序列,分析在已经明确与TRIM5α抗病毒功能密切相关的几个位点上是否发生可能影响其功能的突变。结果:在平顶猴基因组上CypA基因融合到TRIM5α基因第八外显子的下游,融合方式与在鹰猴中发现的CypA与TRIM5α的融合方式完全不同。恒河猴TRIM5α基因具有限制HIV-1复制的功能,第332位脯氨酸对其抗病毒功能非常重要,但在平顶猴的TRIM5α上,该氨基酸突变成谷氨酰胺;第335位以后8个氨基酸对恒河猴TRIM5α抗病毒功能也有重要影响,但在平顶猴的TRIM5α上,与其对应的氨基酸片段不仅缺失了两个氨基酸,还有两个氨基酸发生突变,附近区域还有另外两个发生突变。在平顶猴TRIM5α基因的Coiled-Coil结构域插入了13个氨基酸,但没有影响到编码框。结论:在平顶猴的基因组上CypA与TRIM5α的融合以及平顶猴TRIM5α基因抗病毒功能关键位点上的氨基酸突变可能影响其抗病毒功能,是其成为唯一能够被HIV-1感染的旧大陆猴以及在被SIV感染时出现较其他旧大陆猴严重临床症状的重要原因。
- 刘红亮郑永唐况轶群马远方
- 关键词：HIV-1基因突变
- 抗人DR5单克隆抗体诱导HL-60细胞凋亡机制
- 2012年
- 探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导白血病细胞系HL-60细胞凋亡的可能机制。MTT法检测mDRA-6对HL-60细胞的生长增殖的影响,以及Caspase 8、10、3抑制剂对mDRA-6抑制HL-60细胞生长增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测HL-60细胞DNA片断化降解;Western blot检测mDRA-6对HL-60细胞Caspase 8、10、3的激活改变。结果发现,mDRA-6呈时间、浓度依赖性地抑制HL-60细胞的生长增殖,10 mg/L的mDRA-6作用HL-60细胞6 h、8 h和10h,细胞增殖抑制率分别为23.96%、44.10%和50.28%;琼脂糖凝胶电泳显示,10 mg/L的mDRA-6作用6 h,HL-60细胞呈现凋亡细胞特有的DNA梯形条带;Western blot检测结果发现,mDRA-6作用HL 60细胞不同时间,Caspase 8均只有酶原条带出现,无激活片段产生,而Caspase 10和Caspase 3显示明显裂解片段产生,并随mDRA-6作用时间延长而增多;预先使用15μmol/L的Caspase 10及Caspase 3抑制剂孵育细胞1 h,能够使mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率分别降低64.15%(t=10.13、P<0.01)和53.69(t=8.93、P<0.01)%,而预先使用15μmol/L的Caspase 8抑制剂孵育细胞1 h,mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率仅降低4.40%(t=0.52、P>0.05)。以上实验结果提示,mDRA-6通过激活Caspase 10启动凋亡信号分子,诱导白血病HL-60细胞凋亡。
- 李淑莲王赟张舒曼王靖
- 关键词：死亡受体5单克隆抗体凋亡半胱天冬酶
- NF-κB在抗人DR5抗体诱导白血病细胞系凋亡中的作用被引量：2
- 2010年
- 观察NF-κB在抗人DR5抗体mDRA-6诱导白血病细胞凋亡中的激活,探讨NF-κB在抗人DR5抗体诱导白血病细胞凋亡中的作用。提取细胞蛋白,间接ELISA法检测NF-κB的激活;预先应用NF-κB抑制剂孵育细胞1h,MTT及流式细胞术检测mDRA-6对白血病Jurkat和U937细胞系的凋亡率。结果:mDRA-6作用Jurkat和U937细胞15min,激活形式NF-κB(NF-κBP65)明显增高;10mg/L的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞4h,流式细胞术检测细胞凋亡率分别为56.63%和34.14%,而预先用15μmol/L的NF-κB抑制剂处理细胞1h,mDRA-6所致的Jurkat和U937细胞凋亡率分别增加至75.51%和58.01%。mDRA-6诱导白血病Jurkat和U937细胞凋亡过程中激活NF-κB,激活的NF-κB抑制mDRA-6的肿瘤细胞凋亡诱导作用。
- 李淑莲王靖王赟蔡静马远方
- 关键词：核因子ΚB凋亡白血病细胞
- 热疗对SMMC-7721肝癌细胞形态、增殖、凋亡的影响被引量：7
- 2010年
- 目的探讨热疗对SMMC-7721肝癌细胞的影响。方法将SMMC-7721肝癌细胞置恒温循环水浴锅中(42.5±0.5)℃孵育1h,然后放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养,分别于热处理后0、6、12、24h采用倒置显微镜(LM×400)观察细胞形态变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,予Annexin V/PI染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡,予366EC和FITC-羊抗鼠IgG处理细胞后用流式细胞仪检测细胞DR5表达,用Fluo-3/AM负载细胞检测胞内Ca2+浓度的变化。结果热疗可导致肿瘤细胞形态改变,表现为细胞变小,变圆,脱落,出现空泡;热疗可抑制细胞增殖,细胞热疗后0、6、12、24h细胞抑制率分别为22.18%、26.76%、31.30%、36.62%。热疗后0h细胞凋亡率为15.00%,其中早期凋亡率为2.00%,晚期凋亡率为13.00%;热疗后6h细胞凋亡率为65.45%,其中早期凋亡率为43.23%,晚期凋亡率为22.22%;热疗后12h细胞凋亡率为12.32%,其中早期凋亡率为4.60%,晚期凋亡率为7.72%;热疗后24h细胞凋亡率为22.58%,其中早期凋亡率为7.15%,晚期凋亡率为15.43%。热疗后0、4、8、12、24h细胞内钙离子浓度分别为18.13、7.87、13.01、37.23μmol/L,对照组为14.28μmol/L。热疗后0、6、12、24h细胞膜DR5表达率分别为79.74%、83.22%、91.28%、92.52%,对照组为83.02%。结论热疗导致肿瘤细胞凋亡的因素是复杂的,DR5表达增加和细胞内Ca2+增加是原因之一;热疗可增加肿瘤细胞DR5的表达,提示热疗加化疗或其他治疗可能会增加疗效。
- 席子明张军马远方
- 关键词：热疗SMMC-7721肝癌细胞细胞形态凋亡DR5CA2+
- 交联抗人DR5单抗诱导的Jurkat细胞凋亡的信号转导
- 2007年
- 目的探讨抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的死亡受体5(DR5)单抗——YM366EC对Jurkat细胞增殖的影响,闸明抗DR5抗体的抗肿瘤效应机制。方法MTT方法检测抗体对Jurkat细胞存活率,FITC-Annexin V/PI标记流式细胞仪检测交联YM366EC对Jurkat细胞凋亡率影响。交联YM366EC作用于Jurkat细胞2、4、6、8、10、12 h收集细胞,提取蛋白Western blot检测Bcl-2、Cyt-C、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Caspase-9的变化。结果抗DR5抗体单独应用不能抑制高表达DR5分子的Jurkat细胞增殖,但应用抗小鼠IgC交联DR5抗体后可直接诱导TRAIL敏感的Jurkat细胞凋亡改变。并且Western blot检测到随着抗体诱导时间的延长Jurkat细胞Bcl-2蛋白表达减少;Cyt-C、Bax,有活性的Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达增加。结论交联抗DR5抗体YMB66EC对Jur- kat细胞增殖有明显的抑制作用,诱导的Jurkat细胞凋亡的分子机制涉及到Cyt-C、Bax、Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9。
- 白慧玲杜耀武王雪银李淑莲王靖刘广超马远方
- 关键词：交联JURKAT细胞凋亡
- mDRA-6与尼美舒利对Jurkat细胞的杀伤效应被引量：1
- 2007年
- 目的:探讨mDRA-6与尼美舒利对Jurkat细胞有无杀伤作用及二者有无协同效应。方法:常规培养Jurkat细胞,流式细胞术检测细胞表面DR5的表达率,MTT法检测细胞毒性作用,Hoechst33258染色观察Jurkat细胞核形态变化,流式细胞术定量分析凋亡细胞率。结果:①Jurkat细胞表面DR5的表达率为84.83%。②mDRA-6与尼美舒利均能杀伤Jurkat细胞,存在浓度依赖性。400μmol/L的尼美舒利作用细胞10小时,细胞凋亡率为11.51%;0.5ng/ml与1ng/ml的mDRA-6作用细胞10小时,细胞凋亡率分别为3.67%和6.3%;③二者联合具有较好的协同促凋亡作用,400μmol/L的尼美舒利联合0.5ng/ml与1ng/ml的mDRA-6作用细胞10小时,细胞凋亡率分别为50.38%和63.79%。结论:mDRA-6与尼美舒利均有杀伤Jurkat细胞的作用,二者具有较强的协同作用,杀伤作用是通过诱导凋亡实现的。
- 刘英杰马远方张军赵粤萍李淑莲刘广超白慧玲
- 关键词：抗人DR5单克隆抗体MDRA-6尼美舒利凋亡JURKAT细胞
