国家自然科学基金(30571666)
- 作品数：4 被引量：15H指数：2
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- 耐药机制指导下的抗金葡菌药物开发现状被引量：9
- 2007年
- 金黄色葡萄球菌是全球院内感染的首要病原菌,临床分离的金葡菌80%以上为耐甲氧西林(MRSA)菌株,因其耐药性,尤其是多重耐药性的快速增长,抗MRSA感染日益成为抗感染治疗的难点和热点。近年来,人们在充分认识金葡菌耐药机制的基础上,积极开发新型抗MRSA药物,取得了长足发展。对MRSA的耐药机制及该机制指导下抗金葡菌药物开发现状作一综述。
- 杨杰饶贤才
- 关键词：MRSA耐药性药物
- 金葡菌TG-TPase嵌合基因在甲醇营养型酵母中的表达被引量：1
- 2009年
- 目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础。方法在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5α大肠埃希菌。经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用SalⅠ线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母。结果采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873bp的TGase片段和1044bp的TPase片段。以酶切连接构建的TG-TPase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1900bp的融合片段,与预期结果相符,测序表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA。结论成功构建了含TG-TPase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提。
- 杨杰饶贤才侯瑞胡晓梅陈志瑾丛延广谭银铃朱军民周莹冰胡福泉
- 关键词：MRSATGASE毕赤酵母
- 抗耐药性金黄色葡萄球菌嵌合药靶的设计与构建被引量：3
- 2011年
- 目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达、纯化,为进一步利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法运用Bioedit和DNAStar软件对MRSA耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段序列和活性区结构特点及其活性发挥进行分析,设计TG-TPase嵌合药靶,并通过引物设计从MRSA菌株中克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP基因片段,进一步用引物延伸法、酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因并亚克隆至原核表达质粒pET30b中,转化Rosetta(DE3)plysS大肠埃希菌,用IPTG进行诱导表达,并小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化和Western blotting鉴定。结果设计的TG-TPase嵌合药靶包括PBP2分子的TGase活性区、绞链区的N-端,PBP2a分子绞链区C-端及完整的TPase结构域,融合基因为1 935 bp,编码645个氨基酸,等电点为7.10,相对分子质量72 000。用PCR法从MRSA菌株中成功克隆了青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达出药靶蛋白,表达结果与预期设计相符合。融合蛋白纯化分析表明,融合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计、构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,并对融合蛋白进行了初步纯化,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。
- 杨杰饶贤才侯瑞胡珍方昕陈志瑾
- 关键词：MRSA分子设计原核表达
- MRSA耐药相关TG-TPase嵌合基因的原核表达与纯化被引量：2
- 2008年
- 目的设计、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行原核表达、纯化探索,为进一步利用其酶学活性建立抑制剂筛选系统奠定基础。方法通过引物设计,从盐平板法筛选的MRSA菌株中分别克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP片段,分别克隆入T载体,对阳性重组子进行酶切/再连接,构建TG-TPase嵌合基因,经核苷酸测序鉴定正确的嵌合基因再亚克隆到pET22b,构建表达载体,转化Rosetta(DE3)plysS,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE、质谱和Western blotting鉴定。小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化。结果从13株临床分离的金葡菌中筛选出2株高耐药性MRSA菌株,用PCR法从中成功地克隆到青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,产量达菌体总蛋白的43%。融合蛋白纯化分析表明,嵌合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。
- 杨杰饶贤才侯瑞胡晓梅陈志瑾丛延广谭银铃朱军民周莹冰胡福泉
- 关键词：MRSA原核表达纯化
