国家自然科学基金(30571634)
- 作品数：4 被引量：4H指数：2
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- 虫源性IgE依赖组胺释放因子诱导致敏肥大细胞释放组胺的研究
- 2007年
- 目的制备日本血吸虫和华支睾吸虫IgE依赖组胺释放因子重组蛋白rSjHRF和rCsHRF,并观察两者诱导大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能。方法分别克隆SjHRF和CsHRF基因完整编码序列,将重组质粒分别转化大肠埃希菌BL21并诱导表达,亲和层析纯化可溶性表达的重组蛋白,将纯化的rSjHRF和rCsHRF分别与卵清蛋白变应原致敏的大鼠肺肥大细胞一起孵育,利用荧光分光光度法测定肥大细胞组胺释放量,并制备2种重组蛋白诱导肥大细胞释放组胺的剂量依赖曲线和动力学曲线。结果成功构建重组质粒pET-30-rSjHRF和pET-30-rCsHRF,并获得纯化的可溶性重组蛋白rSjHRF和rCsHRF;2种重组蛋白诱导大鼠致敏肥大细胞释放组胺均具有剂量依赖性,当浓度为150mg/L时,rSjHRF和rCsHRF诱导致敏肥大细胞组胺平均释放率为49.78%和32.63%;2种重组蛋白诱导致敏肥大细胞组胺释放率随时间延长而增加,在反应开始后约35min,组胺释放率达到最高。结论重组虫源性IgE依赖组胺释放因子可诱导大鼠致敏肥大细胞释放组胺,提示该蛋白可能与寄生性蠕虫感染诱导机体Ⅰ型超敏反应的发生相关。
- 陈晓湘胡旭初徐劲余新炳
- 关键词：日本血吸虫华支睾吸虫肥大细胞组胺
- 大鼠IgE依赖组胺释放因子重组蛋白纯化效果的优化
- 2008年
- 目的提高大鼠IgE依赖组胺释放因子(rHRF)的可溶性表达水平,改善其亲和层析纯化效果,为深入研究该重组蛋白的生物学功能奠定基础。方法选择多克隆酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ,将rHRF完整编码区基因从原有的pET-30a-rHRF重组质粒亚克隆至pET-28a载体,构建重组质粒pET-28a-rHRF;转化大肠杆菌BL21(DE3)后,通过改变IPTG浓度(0.1～1.0mmol/L),调节诱导表达温度(25～37℃)和时间(1～5h),筛选能够提高rHRF可溶性表达水平的条件;同时改进亲和层析纯化的条件,提高纯化效果。结果成功构建重组质粒pET-28a-rHRF,不同IPTG浓度、诱导温度和时间对重组蛋白的可溶性表达水平无明显影响。但是,与pET-30a-rHRF转化菌相比,pET-28a-rHRF转化菌所表达的重组蛋白因其N端和C端均带有6×his标签,增强了目的蛋白与树脂的结合力,而使亲和层析纯化效果(重组蛋白的浓度和纯度)显著提高。结论rHRF重组蛋白的可溶性表达水平不受IPTG浓度、诱导表达温度和时间的影响,但是可溶性重组蛋白两端均携带6×his标签可使亲和层析纯化效果显著提高,从而有利于获得足量rHRF用于进一步的生物学功能研究。
- 陈晓湘胡旭初徐劲余新炳
- 关键词：原核表达载体蛋白质纯化
- 寄生虫IgE依赖组胺释放因子抗体抑制致敏肥大细胞释放组胺作用的研究被引量：2
- 2008年
- 目的观察抗寄生虫IgE依赖组胺释放因子(HRF)抗体对重组大鼠IgE依赖组胺释放因子(rRHRF)诱导致敏肥大细胞释放组胺功能的影响。方法用纯化的日本血吸虫和华支睾吸虫IgE依赖组胺释放因子重组蛋白rSjHRF和rCsHRF分别免疫大鼠,分离免疫血清并通过亲和层析纯化出总IgG。将rRHRF(终浓度为75μg/mL)分别与2种纯化抗体(浓度梯度为3/5,2/5,1/5,0)37℃预先反应30min后,再加入卵清蛋白变应原致敏的大鼠肺肥大细胞,利用荧光分光光度法测定rRHRF诱导肥大细胞组胺释放量。实验中采用未致敏大鼠血清纯化所得总IgG作为对照。结果得到了纯化的抗rSjHRF IgG和抗rC-sHRFIgG,抗rCsHRF IgG和抗rSjHRF IgG可明显抑制大鼠内源性IgE依赖HRF诱导致敏肥大细胞释放组胺的功能,但抗体抑制作用的强弱与抗体浓度之间的剂量依赖关系还需进一步实验验证。结论抗寄生虫IgE依赖组胺释放因子抗体具有抑制大鼠IgE依赖组胺释放因子诱导致敏肥大细胞释放组胺的作用,可能是参与寄生虫感染抑制宿主Ⅰ型超敏反应发生的免疫学机制之一,为预防和控制Ⅰ型超敏反应提供了新的思路。
- 陈晓湘胡旭初徐劲余新炳
- 关键词：日本血吸虫华支睾吸虫肥大细胞
- 大鼠IgE依赖组胺释放因子基因的克隆表达及其功能研究被引量：2
- 2008年
- 目的:获得原核表达的可溶性大鼠IgE依赖组胺释放因子(rHRF),并检测其诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能。方法:克隆Wistar大鼠rHRF基因完整编码区序列并在BL21细胞中进行原核表达,纯化的可溶性重组rHRF刺激卵清蛋白变应原致敏的大鼠肺肥大细胞,利用荧光分光光度法测定组胺释放量。结果:测序证实克隆基因与GenBank中大鼠IgE依赖组胺释放因子(又称翻译控制肿瘤蛋白)mRNA序列的一致性为97%,推测的氨基酸序列一致性为95%。SDS-PAGE显示重组rHRF相对分子质量(Mr)约为24000;重组rHRF诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺不依赖变应原,且呈剂量依赖关系。结论:rHRF具有不依赖变应原诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能,可能在Ⅰ型超敏反应过程中发挥重要作用,为进一步研究rHRF的免疫学功能打下基础。
- 陈晓湘胡旭初徐劲郑南才余新炳
- 关键词：基因克隆原核表达肥大细胞组胺
