国家自然科学基金(30571649)
- 作品数：7 被引量：3H指数：1
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- HBV preS1蛋白及ASGPR的亚细胞定位及其在肝组织中的分布
- 2017年
- 目的检测HBV preS1蛋白及ASGPR的亚细胞定位及在肝组织中的分布情况,为研究二者的生物学功能提供依据。方法激光共聚焦显微镜检测HBV preS1蛋白及ASGPR在HepG2细胞中的亚细胞定位情况以及二者是否存在共定位;免疫组织化学技术检测HBV preS1蛋白和ASGPR在肝组织中的表达情况。结果激光共聚焦显微镜下观察,在HepG2细胞的胞膜、胞质及胞核中均可见明亮的绿色荧光,表明HBV preS1蛋白弥散分布于肝细胞的胞膜、胞质及胞核中;在胞膜上可见明亮的红色荧光,而胞质中的红色荧光较弱,表明ASGPR主要表达于肝细胞膜上,在肝细胞质中呈弱表达。提示在HepG2细胞的细胞膜上HBV preS1蛋白与ASGPR具有共定位。在乙肝肝硬化患者的肝组织中,HBV preS1蛋白在肝细胞的胞膜、胞质及胞核中均有阳性表达;ASGPR不仅在肝细胞膜上有阳性表达,在胞质中的表达率也较高。此外,ASGPR在肝组织中的分布形式与HBV preS1蛋白无明显差异(P>0.05),并且二者的表达水平呈显著正相关(Pearson相关系数0.776,P<0.000 1)。结论 ASGPR除介导HBV入侵外,可能还参与了病毒的分泌及胞内运输等其他生命活动。
- 张曦刘小静陈云茹孔颖杨雪亮张凯安小翠叶峰蔺淑梅
- 关键词：乙型肝炎病毒PRES1蛋白细胞定位
- HBV preS1基因酵母表达载体的构建及表达被引量：1
- 2009年
- 目的构建HBV preS1基因的酵母表达载体,探讨HBV preS1蛋白的功能。方法以HBVayw亚型全长质粒PCP10为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HBV preS1基因,克隆到pGEM-T载体中命名为T-preS1,以NcoⅠ和MluⅠ双酶切T-preS1后回收与酵母表达载体pSos连接,对重组质粒进行序列测定后命名为pSos-preS1,经醋酸锂法将其转化酵母菌cdc25(a),提取酵母蛋白质进行Western免疫印迹分析。结果成功构建了HBV preS1基因的酵母表达载体,Western免疫印迹分析显示HBV preS1基因在酵母细胞中正确表达。结论pSos-preS1的构建为通过SOS招募系统(sos-recruit ment system,SRS)筛选与HBV preS1蛋白相互作用的蛋白和进一步探讨HBV preS1蛋白在HBV致病中的作用奠定了基础。
- 张曦蔺淑梅吴列秀陈天艳叶峰赵英仁张树林
- 关键词：乙肝病毒PRES1蛋白酵母表达载体
- HBV PreS1蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测
- 2009年
- 目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵质粒,并检测其表达产物对cdc25酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法聚合酶链反应(PCR)扩增HBV PreS1基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-PreS1,经测序正确后其将转化酵母菌cdc25感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用。结果序列测定证实重组诱饵质粒pSos-PreS1构建成功。重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用。结论可以利用SRS来研究与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究乙型肝炎病毒的致病机制奠定了基础。
- 张曦蔺淑梅吴列秀陈天艳叶峰赵英仁张树林
- 关键词：自激活作用
- 基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因C1反式调节基因
- 2007年
- 目的对未知功能基因C1转染人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)后的基因表达谱进行分析,探索该基因的表达对肝细胞基因表达谱的影响及其可能的调节功能线索。方法以分子生物学技术构建C1的真核表达载体pcDNA3.1(-)-C1,以表达质粒pcDNA3.1(-)-C1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果HepG2细胞经转染C1表达质粒后,有26条差异表达基因,其中24条基因表达水平下调,2条基因表达水平上调。这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、细胞增生分化及肿瘤的发生密切相关。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了C1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明C1蛋白可能的生物学功能及乙型肝炎病毒核心蛋白的致病机制提供了理论依据。
- 蔺淑梅成军杨媛刘敏张黎颖郭江
- 关键词：乙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因基因表达谱芯片
- ASGPR与HBV preS1蛋白之间相互作用的验证被引量：1
- 2016年
- 目的验证去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)与乙肝病毒前S1蛋白(HBV preS1蛋白)之间的相互作用,确认ASGPR作为乙肝病毒肝细胞膜受体在介导乙肝病毒感染的分子机制中的作用。方法分别用哺乳动物双杂交及体外免疫共沉淀技术验证ASGPR与HBV preS1蛋白之间的相互作用,操作方法参照试剂盒说明书进行。结果哺乳动物双杂交实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在细胞环境中具有相互作用;免疫共沉淀实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在非细胞环境中具有相互作用。结论 ASGPR可能是介导HBV入侵的肝细胞膜受体之一。
- 张曦刘小静陈云茹孔颖杨雪亮叶峰蔺淑梅
- 关键词：乙型肝炎病毒PRES1蛋白蛋白质-蛋白质相互作用免疫共沉淀
- 抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白相互作用蛋白编码基因C1的反式调节基因
- 2006年
- 目的筛选、克隆与乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)相互作用的蛋白基因C1的反式激活基因,探索该基因可能的生物学功能.方法以分子生物学技术构建C1真核表达载体pcDNA3.1(-)-C1,以表达质粒pcDNA3.1(-)-C1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选阳性克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果成功构建人类新基因C1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后挑选40个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段,随机挑选含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得18种编码基因.结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期及代谢、肿瘤发生发展及肝脂肪变及肝纤维化发生发展密切相关的蛋白编码基因,推测了C1在体内可能存在的调控机制的线索.
- 蔺淑梅张树林成军刘敏郭江张黎颖杨媛
- 关键词：抑制性消减杂交反式激活克隆乙型肝炎病毒
- 酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白被引量：2
- 2012年
- 目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。
- 叶峰张曦邸莹王小清刘小静孔颖赵英仁陈天艳刘敏
- 关键词：酵母双杂交系统PRES1蛋白诱饵载体
