国家自然科学基金(30271342)
- 作品数：9 被引量：23H指数：2
- 相关作者：刘友生王长松李红陈燕平葛晓冬更多>>
- 相关机构：第三军医大学西南医院第三军医大学更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生环境科学与工程更多>>
- 用杆状病毒-昆虫细胞系统表达、纯化重组的人源化氨基末端LBP被引量：1
- 2004年
- 根据已有的资料显示LBP与LPS的结合位点位于其氨基末端的第 91～ 1 0 0个氨基酸残基。在体外构建含有人LBP与LPS结合活性部分的穿梭质粒pBacmidtLBP ,并且带上 6×his的标签 ,用此穿梭质粒转染sf2 1昆虫细胞 ,获得重组病毒。然后用重组病毒液感染对数生长期的sf2 1昆虫细胞 ,72h后收获含有这种截断型人源化氨基末端LBP (NH LBP)的培养上清。用金属亲和树脂纯化后 ,采用SDS PAGE电泳以及Western Blot鉴定所得到的纯化物。成功获得相对分子质量约为 30 0 0 0的NH LBP。为进一步研究LBP在介导LPS活化靶细胞中的作用机制奠定了基础。
- 王长松刘友生葛晓冬李红陈燕平
- 关键词：LBP昆虫细胞人源化穿梭质粒重组病毒
- 人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定被引量：15
- 2005年
- 目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。
- 葛晓冬刘友生王晓东王长松邓军李红
- 关键词：人源噬菌体抗体库昆虫细胞
- 人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达
- 2006年
- 目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。
- 孙亚丽刘友生王长松
- 关键词：突变蛋白表达
- 抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选被引量：2
- 2005年
- 目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。
- 王长松刘友生李红葛晓冬邓军陈燕平
- 关键词：体外表达脂多糖结合蛋白抗体库外周血单核细胞可变区
- 蛋白质体外表达与进化技术被引量：1
- 2005年
- 蛋白质体外表达与进化技术包括核糖体展示技术和mRNA展示技术。与蛋白质体内表达系统相比,体外表达技术可产生较大容量的蛋白质文库(约1012～1013左右),同时在回收编码蛋白质的信息时对文库进行了进化,增加了蛋白质文库的多样性,促进了抗体或配体类蛋白质的亲和成熟能力。该文介绍了蛋白质体外表达技术在新蛋白质(如抗体或配体等)表达筛选中的应用。
- 王长松刘友生陈燕平
- 关键词：核糖体展示进化
- 抗氨基端脂多糖结合蛋白单链抗体的生物学活性研究
- 2005年
- 目的观察制备的抗NHLBP单链抗体的体内外生物学活性`。方法采用流式细胞术观察抗NHLBP单链抗体阻断LPS与U937细胞的结合能力;采用ELISA法检测抗体干预后不同时相点的烧伤合并内毒素血症小鼠血浆中炎性细胞因子TNFα、IL6含量的变化;同时观察小鼠部分内脏器官的病理形态学改变。结果经抗NHLBP单链抗体干预后,U937细胞表面的荧光强度明显下降。烧伤合并内毒素血症小鼠经scFv抗体干预后,与模型组相比肝、肺组织的炎性改变明显减轻、浸润的炎细胞减少;肾组织的炎性改变不明显;小鼠血浆中TNFα浓度在烧伤合并内毒素处理后即显著增高,模型组与对照组相比,差异有显著性(P<0.01,P<0.05),干预组与相应时相点的模型组相比,在最初3h内差异有显著性(P<0.05)。IL6含量在建模3h以后与对照组相比差异有显著性(P<0.01,P<0.05);干预后IL6的含量下降比较明显。结论抗人源化氨基端脂多糖结合蛋白的单链抗体对内毒素血症有一定的保护作用;进一步明确了LBP在内毒素生物学效应中的作用。
- 章容王长松刘友生李红
- 关键词：单链抗体内毒素血症生物学活性
- 运用生物信息学技术分析预测抗氨基末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)单链抗体的结构
- 2006年
- 应用生物信息学技术预测人工构建的人源化抗氨基末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)单链抗体(scFv)的结构及其生物学活性。利用在线生物信息学工具分析抗NH-LBP的scFv的理化特性及该抗体的二、三级结构。预测结果表明抗NH-LBP的scFv属于较稳定蛋白质,体内半衰期较长;该抗体与数据库中收录的单链抗体的二级结构十分相似;该抗体的三维空间结构为一种球形的蛋白质。通过在线生物信息学工具获得了抗NH-LBP scFv的一、二、三级结构及理论功能,为进一步研究该抗体的体内外生物学活性提供了理论依据。
- 刘友生王长松陈燕平
- 关键词：SCFV生物信息学
- 重组人脂多糖结合蛋白的氨基末端片段在昆虫细胞中的表达、纯化及功能鉴定被引量：1
- 2004年
- 目的 以昆虫sf2 1、sf9细胞表达、分泌人源脂多糖结合蛋白的氨基末端片段 (NH LBP) ,并初步观察其生物学特性。方法 以昆虫sf2 1和sf9细胞于完全Grace培养基中分别扩增编码人源NH LBP的杆状病毒 ,再以sf2 1和sf9细胞于SF 90 0Ⅱ无血清培养基中表达NH LBP ,并以TALON柱芯对NH LBP进行亲和纯化 ,此后以Tris Tricine电泳、毛细管电泳、流式细胞分析实验 (flowcytometryanalysis)、TNFa分泌实验的方法鉴定NH LBP的纯度及生物学活性。结果 昆虫sf2 1和sf9细胞均能有效地扩增编码NH LBP的杆状病毒 ,其中sf9细胞扩增病毒的能力为sf2 1细胞的 1 18倍。sf2 1细胞成功地表达、分泌NH LBP ,并经TALON柱芯亲和纯化 ,其纯度达 98%,NH LBP具有明确的与脂多糖 (LPS)结合的生物学活性 ,而sf9细胞却不能表达、分泌NH LBP。结论 以昆虫sf2 1细胞分泌表达具有活性人源NH LBP是可行的 ,昆虫sf9细胞可扩增编码NH LBP的杆状病毒 ,但不能表达、分泌NH LBP。
- 葛晓冬刘友生王晓东王长松邓军
- 关键词：昆虫细胞无血清培养基杆状病毒
- 介绍一种简便的DNA胶回收方法被引量：3
- 2005年
- 王长松刘友生李红陈燕平
- 关键词：回收方法DNA经济适用回收法
