国家自然科学基金(30170844)
- 作品数：10 被引量：57H指数：5
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- 相关机构：北京大学北京大学第一医院徐州医学院附属医院更多>>
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- 干扰素α对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用被引量：9
- 2005年
- 目的利用丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞模型,体外研究干扰素α(IFN-α)对HCV复制子的抑制作用,并探讨 IFN-α信号传导与激活转录分子( STAT )及介导 IFN-α抗病毒作用的干扰素刺激基因(ISGs)的表达水平.方法以HCV复制子质粒为模板体外转录合成HCV复制子RNA, 将此RNA 转染Huh7肝癌细胞并经G418筛选,建立HCV复制子细胞株;用不同剂量(0～5000 IU/ml) IFN-α处理HCV复制子细胞72 h或用1000 IU/ml IFN-α处理细胞不同时间(0、 24、 48、 72、 96h),通过半定量RT-PCR及实时定量PCR同时检测HCV RNA,Western印迹检测HCV NS5A蛋白表达水平,研究IFN-α对HCV复制子的抑制作用.结果 IFN-α能明显抑制HCV RNA的复制,10 IU/ml 及25 IU/ml IFN-α可使HCV RNA较无IFN-α处理的对照细胞分别降低约68%及75%;IFN-α 1000 IU/ml作用24 h或96 h导致HCV RNA较对照组分别降低75%及88%,同样,IFN-α对HCV NS5A蛋白的合成也有明显抑制作用,说明IFN-α的抗HCV作用呈剂量及时间依赖性;HCV复制子细胞中有抗病毒作用的 ISG(PKR、2'5'OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ)呈明显的IFN诱导性表达.结论 IFN-α能明显抑制HCV RNA的复制,其抑制作用与IFN-α剂量及作用时间有关,PKR、2'5'OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ等ISG可能介导IFN-α的抗HCV作用.
- 贾因棠魏来蒋栋丛旭费然
- 关键词：干扰素ΑC型肝炎样病毒属复制子
- 腺病毒介导的白细胞介素-12表达对丙型肝炎病毒包膜2基因免疫的调节
- 2004年
- 目的 观察腺病毒介导表达白细胞介素-12(IL-12)对调节丙型肝炎病毒(HCV)包膜基因2(E2)诱导免疫应答的影响。 方法 以NIH 3T3细胞表达HCV E2糖蛋白,纯化后用于酶免疫分析法检测抗E2抗体;以表达HCV E2糖蛋白的SP2/0细胞51Cr释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答;以293细胞繁殖表达重组IL-12亚单位p35和p40的腺病毒ADIL12。6-8周龄BALB/C鼠右后肢股四头肌注射表达HCV E2的质粒,同时经腹腔注射ADIL12。分别于2、3、4周尾静脉采血检测抗E2抗体,4周处死动物分离脾细胞检测CTL应答。 结果 表达HCV E2的基因免疫可有效诱导特异性抗E2体液免疫应答。腹腔注射后,外源性IL-12微量表达。微量表达的外源性白细胞介素-12不影响特异性抗E2体液免疫应答。同时,显著增强特异性CTL应答的作用。 结论 腺病毒微量表达的IL-12对HCV E2基因免疫诱导的特异性CTL应答具有调节作用。
- 吴朝栋李红桂陶其敏魏来
- 关键词：抗E白细胞介素-12IL-12丙型肝炎病毒糖蛋白3T3细胞
- 丙型肝炎病毒感染患者13～14年后病毒组织学随访观察被引量：4
- 2005年
- 目的了解丙型肝炎病毒(HCV)感染后持续活动者的临床转归和肝脏组织学情况。方法5例因输血而感染丙型肝炎者,为女性,4例因单采血浆还输血球而感染丙型肝炎者,为男性,总共9例,所有感染者感染时间、感染途径清楚。采用炎症分级纤维化分期以及修正的Knodell评分对肝脏活检组织的炎症和纤维化程度进行评价,超声检查,血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)采用速率法,抗HCV采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,HCVRNA定性检测采用RocheCobasHCV聚合酶链反应(PCR)试剂盒,HCVRNA定量采用BayerHCV分枝DNA(bDNA)试剂盒,HCVRNA基因型采用BayerLiPA基因型分析方法。结果(1)9例慢性丙型肝炎感染者共随访13～14年,其间于诊断时、1992、1995、1999、2003、2004年共检测6次ALT水平,均高于正常上限值(ULN)。(2)2004年检测9例慢性丙型肝炎感染者HCVRNA定性均为阳性,定量从3.57×108拷贝/L～7.21×109拷贝/L,大于2.00×109拷贝/L者5例。3例感染者为基因2型,其余6例为基因1b型。(3)9例慢性丙型肝炎感染者超声诊断为慢性炎症轻度者3例(3/9),占33.3%;中度6例(6/9),占66.7%;重度0例;脂肪肝1例(1/9),占11.1%。未发现失代偿性肝硬化和原发性肝癌。(4)9例慢性丙型肝炎感染者的肝组织炎症活动度(HAI)分数为5～8.5分。
- 饶慧瑛魏来赵景民孙德贵郭芳马慧房继莲邵杰张兰芳孙焱王豪
- 关键词：丙氨酸氨基转移酶(ALT)随访观察肝组织炎症活动度失代偿性肝硬化HCVRNA
- 树突状细胞的非特异性免疫功能降低对HBV、HCV清除及细胞毒性T淋巴细胞应答无影响被引量：7
- 2004年
- 目的 观察HBV、HCV感染者树突状细胞(DC)的非病毒特异性免疫功能状态与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答以及病毒清除的关系。方法 对25例成人慢性HBV和HCV合并感染者进行了间隔8年的两次调查,依据临床转归分为HBV和HCV均清除组(A组)14例,单独HCV清除者(B组)6例,单独HBV清除者(C组)3例,HBV和HCV均未清除者(D组)2例,对照组(N组)为同一地区健康献血员11例。体外分离培养D C,检测其表型及抗原摄取功能、刺激异体淋巴细胞增殖能力和4组感染者的CTL免疫应答情况。 结果 B、C、D组与A组、N组比较,DC的非病毒特异性免疫功能降低,表现为CD86表达的降低、刺激异体淋巴细胞增殖的能力下降以及抗原摄取能力降低。A组对HBV和HCV的4条抗原表位多肽均有较高的CTL应答率(12/12);B组对HCV的两条抗原表位多肽均有应答(5/5),但无对HBV两条表位多肽均应答者,仅有1例对P2有反应;C组对HBV的抗原表位多肽均有应答,但无对两条HCV表位多肽均应答者;D组及N组对HBV或HCV所有实验多肽均无应答。 结论 HBV和HCV的清除与病毒特异性的CTL应答相关。HBV和(或)HCV持续存在可能是导致DC功能异常的原因。
- 范春蕾陈红松李若冰王松霞从旭费然蒋栋王宇魏来
- 关键词：树突状细胞HBVHCV细胞毒性T淋巴细胞丙型肝炎病毒
- 乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建
- 2004年
- 目的 构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法 以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果 成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论 获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。
- 王燕蒋栋魏来陈红松丛旭费然王宇
- 关键词：前C区质粒乙型肝炎病毒突变株限制性酶切
- 双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制作用被引量：5
- 2006年
- α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子———双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用,通过构建野生型PKR真核表达载体(pPKRwt)及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体(pPKRΔ6),并将pPKRwt/pPKRΔ6与HCV复制子RNA同时转染Huh7细胞进行共表达,用Western印迹检测HCV IRES下游的NPTⅡ蛋白表达水平,与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示:表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞,但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别,但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用,说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中,PKR有一定的抑制作用,但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.
- 贾因棠魏来蒋栋丛旭费然
- 关键词：复制子Α干扰素内部核糖体进入位点
- 干扰素刺激基因ISG20真核表达载体的构建及其抗丙型肝炎病毒复制作用的研究被引量：3
- 2006年
- 目的研究IFN-α抗HCV的作用机理及了解ISG20是否参与介导IFN-α对HCV的抑制作用。方法用RT-PCR法及融合PCR法分别获得野生型及突变型ISG20cDNA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,转染含HCV复制子的Huh7细胞进行瞬时表达,通过Northernblot及Westernblot分别检测HCVRNA及NS5A蛋白水平,研究表达ISG20对HCV复制子的影响。结果构建的野生型及突变型ISG20真核表达载体在mRNA水平及蛋白水平的表达均得到证实,并且发现表达野生型ISG20对HCV复制子RNA有抑制作用。结论成功克隆及表达了ISG20,并对其抗病毒作用进行了初步研究,提示ISG20可能介导IFN-α对HCV的抑制作用。
- 贾因棠魏来蒋栋丛旭费然
- 关键词：干扰素克隆丙型肝炎病毒复制子
- 丙型肝炎病毒感染自然过程中准种的构成变化被引量：10
- 2003年
- 目的 观察慢性丙型肝炎患者与自然阴转者外周血HCV准种构成的变化规律。方法应用基因扩增、分子克隆和测序的方法 ,对未接受过治疗的 4例慢性丙型肝炎患者与 4例自然阴转者前后 10年血清中丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus,HCV)核心 (C)区与包膜 2 (E2 )区基因片段进行了序列分析及遗传进化关系比较。结果 4例慢性丙型肝炎患者 10年前后血清HCVC区和其中 2名患者E2区准种群体组内与组间遗传距离没有明显差异。与自然阴转者相比 ,慢性丙型肝炎患者外周血HCVC区和E2区准种群体组内平均遗传距离较大。在同一患者体内HCVE2区准种群体组内遗传距离比C区组内遗传距离大 ,且二者遗传距离大小之间存在相关关系 (rs=0 .80 95 )。结论 在丙型肝炎疾病的自然病程中HCV准种构成可长期保持稳定 ;HCV准种遗传变异度大小可能与丙型肝炎疾病的转归相关。
- 王齐欣魏来高燕陈志军孙德贵蒋栋徐小元陈红松王宇
- 关键词：丙型肝炎病毒自然过程分子克隆基因扩增
- 丙型肝炎病毒感染自然过程中的准种变化被引量：14
- 2004年
- 目的观察丙型肝炎病毒(HCV)持续感染者与自然阴转者外周血HCV准种构成的变化规律。方法应用基因扩增、分子克隆和测序的方法,对未接受过治疗的4例HCV持续感染者与4例自然阴转者前后间隔10年血清中HCV高变区1(HVR1)基因片段进行了序列分析及遗传进化关系比较。结果与持续感染者相比,自然阴转者外周血HCVHVR1区准种群体组内平均遗传距离、熵值较小。4例持续感染者中有3例10年前后血清HCVHVR1准种群体组内与组间遗传距离有明显差异。8例感染者中有7例血清HCV准种KA/KS值大于1。结论在丙型肝炎的自然病程中HCV准种遗传复杂度、变异度大小可能与丙型肝炎的转归相关;HCV准种构成可能发生改变。
- 王齐欣魏来高燕孙德贵蒋栋徐小元陈红松王宇
- 关键词：丙型肝炎病毒感染准种
- 互补引物/模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶被引量：7
- 2002年
- 构建含有感染性克隆HCV非结构基因 5b区序列的酵母表达质粒 ,转化毕加酵母 ,获得持续、可溶性HCVRNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)的表达 ,纯化蛋白在SDS -PAGE及Westernblot中显示出特异性的 6 4 2kDHCVRdRp蛋白带 ,同聚引物 /模板测定显示RdRp的活性极低 ,延长反应时间 ,RNA聚合活性仅轻度升高。采用合成的杂聚互补引物 /模板 ,未发现核苷酸在毕加酵母表达的RdRp作用下掺入模板 ,随时间延长 ,杂聚互补引物 /模板降解。
- 魏来陈红松陈勇封波丛旭王宇
- 关键词：丙型肝炎病毒RNA聚合酶
