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RNA Interference-Mediated Gene Silencing of Vascular Endothelial Growth Factor被引量：1: 2006年; OBJECTIVE To inhibit the expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) by RNA interference, and to observe the effect in different cells line. METHODS Using the services of E-RNAi, we designed and constructed two kinds of shRNAs expression vectors which were aimed at the VEGF gene. These vectors were then transfected into HEK293, colon cancer HT29, Hela and HepG2 cells by LipofectamineTM 2000. The level of VEGF mRNA was determined by RT-PCR and Northern blotting and the VEGF expression was examined by immunofluoresence staining. RESULTS The two kinds of VEGF specific shRNAs expression vectors were found to efficiently inhibit the expression of VEGF in HEK293 and HT29 cells by RT-PCR analysis, with inhibition rates of 72% and 42%, respectively; but the inhibition rates were reduced to 28% in Hela cells and 13% in HepG2 cells. Northern blotting showed that the inhibition rates of VEGF mRNA expression were 88% and 89% in HEK293 and HT29 cells, respectively. The inhibition rate of VEGF protein expression in HT29 cells was 73% based on immunofluoresence staining. CONCLUSION The expression of VEGF was inhibited by RNA interference, but differed with various cells lines, showing that RNA interference was cell-line dependent.; Tiejun LiJianning SongKai KangZanlan HuTongchuan HeBingqiang ZhangCaiquan Zhang; 关键词：脉管 RNA

Dnmt1基因对胃癌细胞株AGS细胞增殖凋亡的影响: 2006年; 目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以Dnmt1(DNAmethyltransferase1)为靶基因,设计构建重组体pshRNA-Dnmt1,研究其对胃癌AGS细胞增殖凋亡的影响.方法:设计shRNA的寡核苷酸片断,再克隆至载体pTZU6+1中构建重组体pshRNA-Dnmt1,转染胃癌细胞株AGS,用WesternBlot检测DNMT1蛋白水平变化,用RT-PCR法评估mRNA水平,MTT法动态监测活细胞数,AO/EB法、电镜和TUNEL观察其促凋亡作用.结果:成功构建重组质粒pshRNA-Dnmt1后,进行序列分析得到确证.RT-PCR检测结果证实:重组质粒pshRNA-Dnmt1对胃癌AGS细胞中Dnmt1基因的转录有着明显抑制作用,转染后24h抑制率在21.63%左右;48h为52.97%;72h为72.06%.WesternBlot检测结果表明:pshR-NA-Dnmt1转染AGS细胞后24h出现DNMT1蛋白表达量减少,抑制率为28.24%;48h为68.54%;72h为81.47%.MTT结果提示:转染后24,48和72h细胞数存活率为对照组的79.49%,51.63%和39.16%.AO/EB法、电镜和TUNEL都看见大量典型的凋亡和坏死细胞,转染后48h的细胞凋亡率由对照组的5%上升为35%左右.结论:重组质粒pshRNA-Dnmt1能特异有效地抑制胃癌细胞株AGS内Dnmt1基因的表达,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,从而为肿瘤的基因治疗开辟了新途径.; 陈道荣王丕龙杨雪琴黄爱龙张秉强陶小红; 关键词：DNMT1基因 RNA 细胞周期

融合蛋白胸腺素α-干扰素与干扰素α对2．2．15细胞抗原表达的影响被引量：1: 2006年; 临床上许多学者把α干扰素（IFN-α）和胸腺素α（TA1）联合起来治疗慢性乙型肝炎,结果发现联用效果明显优于单用IFN-α或TA1[1].; 卢年芳黄爱龙唐霓郑瑞强; 关键词：2.2.15细胞 Α-干扰素抗原表达干扰素Α 融合蛋白联用效果

不同亚型IFN-α对STAT1表达的影响: 2006年; 目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测不同亚型干扰素α(IFN-α2b、IFN-α2a、IFN-α1b)对HepG2细胞内信号传导分子STAT1mRNA表达的影响。方法1000IU/mlIFN-α2b、IFN-α2a、IFN-α1b分别作用于HepG2细胞4、8、16、24h后,用RT-PCR的方法扩增STAT1目的片段,用T-A克隆方法构建定量的标准模板,并用荧光定量PCR方法观察IFN-α2b、IFN-α2a、IFN-α1b作用后HepG2细胞内STAT1mRNA的表达水平。结果经IFN-α2b、IFN-α2a、IFN-α1b处理后,HepG2细胞内的STAT1mRNA水平较未用IFN-α的空白对照组明显上调,并于IFN-α处理8h后STAT1mRNA水平达高峰。此时,IFN-α2b、IFN-α2a和IFN-α1b的STAT1mRNA水平(×107copies/ml)依次为3·59±0·25、2·73±0·43和4·85±0·55,三者之间存在显著性差异。结论IFN-α作用于HepG2细胞后,IFN-α1bSTAT1mRNA的表达水平最高,IFN-α2b次之,IFN-α2a最弱。间接说明IFN-α1b的抗HBV活性较强,IFN-α2b次之,IFN-α2a较弱。; 卢年芳郑瑞强林华黄爱龙杨德刚; 关键词：干扰素-Α 荧光定量聚合酶链反应基因重组

干扰素α抗病毒活性的实验研究被引量：5: 2005年; 目的比较不同亚型干扰素α(IFN α2b、IFN α2a、IFN α1b)对 JAK-信号转导活化转录因子(STAT)通道中重要信号传导分子 STAT1、STAT2、干扰素α受体(IFNAR)、蛋白激酶(PKR)、核糖核酸酶 L(R Nase L)表达的影响，研究其抗病毒活性的差别，并评价 IFN α抗病毒活性的关键性信号传导分子。方法 1000 U/ml 的不同亚型 IFN α分别作用于 HepG2细胞后，用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法检测 HepG2细胞内 STAT1、STAT2、IFNAR、PKR、RNase L mRNA 表达水平。用 western blot 方法检测细胞内 STAT1及 IFNAR 蛋白表达水平。结果 RT-PCR 的实验结果：(1)IFN α1b 处理组 IFNAR、 STAT1、STAT2 mRNA 的表达水平较 IFN α2b 组高，两组比较差异无统计学意义。IFN α1b、IFN α2b 处理组 IFNAR、STAT1、STAT2 mRNA 水平明显较 IFN α2a 组高，差异均有统计学意义，F 值分别为5．26、 15．6、4．67，P 值均＜0．05。(2)IFN α1b、IFN α2b、IFN α2a 处理后的 PKR 表达水平相似，3组比较差异无统计学意义。(3)RNase L 表达量极少，无法比较不同处理组间 RNase L mRNA 表达水平的差异性。Western blot 实验结果：(1)IFN α1b 处理组 IFNAR、STAT1蛋白水平较 IFN α2b 处理组高，两者比较差异无统计学意义，IFN α1b、IFN α2b 处理组 IFNAR、STAT1蛋白水平较 IFN α2a 处理组明显升高，差异有统计学意义，F 值分别为17．7、20．1，P 值均＜0．05。结论 IFN α2b、IFN α2a、IFN α1b 均可促进 JAK-STAT 信号通道中 STAT1、STAT2、IFNAR mRNA 及蛋白表达，IFN α1b 和 IFN α2b 作用较强，IFN α2a 作用较弱。初步表明，IFN α1b、IFN α2b 的抗病毒活性较 IFN α2a 强，IFNAR、STATl、STAT2可作为评价 IFN α抗病毒活性的关键性指标，而 PKR、RNase L 能否作为评价指标有待进一步的实验证实。; 卢年芳黄爱龙唐霓郑瑞强林华朱亚彬吴莹陶鹏; 关键词：干扰素Α 信号传导治疗学

不同亚型干扰素α的抗乙型肝炎病毒活性研究: 2009年; 我们用Abbot试剂盒检测干扰素（IFN）α2b、IFNα2a、IFNα-1b对HepG2．2．15细胞分泌的HBsAg、HBeAg的抑制率，用RT～PCR、Westernblot以及荧光定量PCR方法检测基因应答水平上信号传导分子STAT1 mRNA及蛋白质表达水平，比较信号传导分子的表达水平与IFNd对ItBsAg和HBeAg抑制率的关系，以探讨用信号分子STAT1作为一种新的抗病毒评价标准的可能性。同时通过不同试验方法的比较，以寻求一种更好的评价IFNα抗病毒活性的方法。; 卢年芳黄爱龙郑瑞强林华杨德刚陈齐红邵俊於江泉; 关键词：肝炎病毒乙型干扰素Α 聚合酶链反应荧光定量

pshRNA-DNMT1介导的胃癌AGS细胞凋亡的体内外研究: 2006年; 目的构建沉默DNMT1基因的重组体pshRNA-DNMT1,研究其体内外对胃癌AGS细胞增殖凋亡的影响。方法设计短发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸片断,克隆到载体pTZU6+1中,构建重组体pshRNA-DNMT1,转染胃癌细胞株AGS,用Western印迹检测DNMT1蛋白质水平变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法评估mRNA水平,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)动态监测活细胞数,电镜和原位末端标记技术(TUNEL)观察其体外的促凋亡作用。构建裸鼠胃癌模型,经pshRNA-DNMT1处理后观察瘤体大小,绘制生长曲线;用苏木素伊红(HE)染色法、电镜和TUNEL检测细胞凋亡,用增殖细胞核抗原(PCNA)法评价细胞的增殖能力。结果成功构建重组质粒pshRNA-DNMT1后,进行序列分析得到确证。pshRNA-DNMT1转染AGS细胞后24h出现DNMT1蛋白质表达量减少,抑制率为28·24%,48h为68·54%,72h为81·47%,重组质粒pshRNA-DNMT1对胃癌AGS细胞中DNMT1基因的转录有着明显抑制作用,转染后24h抑制率为21·63%,48h为52·97%,72h为72·06%。转染后24、48和72h细胞数存活率为PBS组的79·49%、51·63%和39·16%。pshRNA-DNMT1能抑制肿瘤生长,呈一定的时间和剂量依赖性。结论重组质粒pshRNA-DNMT1能特异有效地抑制胃癌细胞株AGS内DNMT1基因的表达。在胃癌细胞株AGS的体内外实验中均能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。; 陈道荣王丕龙黄爱龙张秉强; 关键词：胃肿瘤脱噬作用

应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染被引量：26: 2005年; 目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达(A值为4.08～9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%～10%;pSI C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04～1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT PCR示肝内HBVCmRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI Cmut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。; 吴莹黄爱龙唐霓张秉强卢年芳; 关键词：急性乙型肝炎小鼠病毒感染 RNA干扰 MRNA水平

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国家自然科学基金(30300298)

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