国家自然科学基金(30600570)
- 作品数：8 被引量：14H指数：2
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- A20和Caspase 3在异基因CD8^+T细胞致人脐静脉内皮细胞凋亡中的表达及意义
- 2008年
- 目的探讨异基因造血干细胞移植时,供体CD8+T细胞致受体人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡中A20蛋白及Caspase3的表达及意义。方法采用密度梯度法分离人周围血单个核细胞,CD8+T细胞亚群阴性分选柱试剂盒分选出CD8+T细胞。HUVEC细胞株经过5ng/mlTNF-α处理后与CD8+T细胞进行混合培养。以AnnexinⅤ和PI双标后,流式细胞仪对HUVEC进行凋亡分析,用全波长荧光分光光度计测定凋亡相关蛋白Caspase3的活性。Westernblot法检测HUVEC中A20蛋白的表达。结果异基因CD8+T细胞在与HUVEC混合后可引起HUVEC凋亡,流式细胞仪检测显示24h时的早期凋亡率最高,达(83.6±0.42)%。而晚期凋亡相关蛋白Caspase3活性在48h时达高峰,荧光强度为(13.585±0.269),此后显著降低,与对照组比较差异有极显著性意义(P<0.01)。A20蛋白的表达与HU-VEC的凋亡率呈负相关(r=-0.839,P<0.05)。结论体外供体CD8+T细胞致受体HUVEC凋亡过程中,信号蛋白Caspase3的激活介导了凋亡的发生,而A20可能对其起负调节作用。
- 韩红黎纬明邹萍董继华刘峥嵘李泉
- 关键词：人脐静脉内皮细胞细胞凋亡CASPASE3
- MAPK和caspase-3在异基因CD8^+T淋巴细胞诱导血管内皮细胞凋亡中的作用被引量：8
- 2009年
- 目的:探讨MAPK和caspase-3在异基因CD8+T细胞诱导血管内皮细胞凋亡中的作用。方法:免疫磁珠阳性分选异基因CD8+T细胞,AnnexinⅤ/FITC试剂盒检测异基因CD8+T细胞诱导的HUVECs和HD-MECs凋亡率,Western blotting检测血管内皮细胞内caspase-3、MAPK表达。观察SB203580(p38MAPK抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)、PD98059(ERK抑制剂)、Z-DEVD-FMK(caspase-3抑制剂)对内皮细胞凋亡的影响。结果:异基因CD8+T细胞作用24 h和48 h后,HUVECs凋亡率分别为41.7%±10.1%和29.4%±8.3%,HDMECs凋亡率分别为28.9%±7.2%和15.2%±4.8%,与对照组相比均具有显著差异(P<0.01)。异基因CD8+T细胞作用后,HUVECs和HDMECs内磷酸化p38MAPK表达、caspase-3裂解增强,而磷酸化JNK、ERK无明显变化。Z-DEVD-FMK和SB203580可显著抑制异基因CD8+T细胞诱导的HUVECs和HEMEC凋亡,并降低内皮细胞caspase-3表达。结论:p38MAPK和caspase-3介导了异基因CD8+T细胞诱导的血管内皮细胞凋亡。
- 李泉张剑黎纬明邹萍
- 关键词：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3P38MAPK细胞凋亡血管内皮细胞
- JNK、P38-MAPK、IκB-α在异基因CD4^+T细胞致人脐静脉内皮细胞损伤中的表达及与TF的关系被引量：1
- 2013年
- 目的检测磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、P38-丝裂原活化的蛋白激酶(P38-mitogen activated protein kinase,P38-MAPK)、核转录因子抑制因子(IκB-α)及组织因子(tissue factor,TF),在异基因及同基因CD4+T细胞与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)混合培养时在HUVECs中的表达,分析JNK、P38-MAPK、IκB-α与TF的相关性,探讨TF在异基因造血干细胞移植急性移植物抗宿主病(aGVHD)血管内皮损伤中可能的作用机制。方法体外原代分离培养HUVECs,用人T细胞亚群阴性分离柱试剂盒,从健康志愿者周围血中分离出CD4+T细胞作为异基因实验组,以同基因CD4+T细胞为对照组,用γ干扰素预处理HUVECs后与CD4+T细胞混合培养,分别在培养前及培养后不同时间点用流式细胞仪检测HUVECs中TF抗原的表达,实时定量PCR检测TF-mRNA基因的转录状况,Western blot检测磷酸化JNK、P38-MAPK、IκB-α的蛋白含量。结果异基因组TF及磷酸化JNK、P38-MAPK、IκB-α的表达明显升高,与对照组在不同时间点比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。相关性分析显示,TF与磷酸化JNK、P38-MAPK表达呈正相关,而与磷酸化IκB-α表达无相关性。结论 TF可能通过JNK、P38-MAPK信号通路参与异基因造血干细胞移植时aGVHD血管内皮细胞的活化与损伤。
- 韩红黎纬明邹萍樊晓武黄畦
- 关键词：C-JUN氨基末端激酶混合淋巴细胞反应
- 异基因CD8^＋T淋巴细胞诱导血管内皮细胞凋亡的分子机制被引量：2
- 2009年
- 目的研究异基因CD8^＋T淋巴细胞诱导血管内皮细胞凋亡的分子机制。方法磁珠分选正常人外周血CD8^＋T淋巴细胞，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（FITC）试剂盒检测异基因CD8^＋T淋巴细胞作用后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人皮肤微血管内皮细胞（HDMEC）凋亡率，RT—PCR检测蛋白酶激活受体1（PAR-1）mRNA表达，Western印迹检测内皮细胞PAR-1、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3表达。结果HUVEC与HDMEC在基因和蛋白水平均有PAR-1表达。异基因CD8^＋T淋巴细胞作用24h和48h，HUVEC凋亡率分别为51．7％±4．1％和29．4％±3．3％，HDMEC凋亡率分别为28．9％±2．2％和15．2％±1．8％，均显著高于对照组（均P〈0．01）；SFLLRN（PAR-1激动剂）诱导两种内皮细胞凋亡的作用与异基因CD8^＋T淋巴细胞的差异无统计学意义（P〉0．05）。异基因CD8^＋T淋巴细胞作用后，HUVEC与HDMEC磷酸化p38MAPK表达均高于对照组（均P〈0．05），30min时分别为对照组的9．8、6．3倍，Caspase-3裂解增加，峰值分别为对照组的5．1、4．3倍；SFLLRN作用后，HUVEC与HDMEC磷酸化p38MAPK表达亦均高于对照组（均P〈0．05），30min时分别为对照组的9．8、6．3倍，Caspase-3裂解增加，峰值分别为对照组的5．7、2．9倍。JNK磷酸化无明显变化。PAR-1抗体和p38MAPK抑制剂（SB203580）可显著降低异基因CD8^＋T淋巴细胞诱导的内皮细胞凋亡（P〈0．01）。结论异基因CD8^＋T淋巴细胞通过PAR-1途径引起细胞内p38MAPK激活、Caspase-3裂解，从而诱导血管内皮细胞凋亡。
- 李泉张剑黎纬明邹萍
- 关键词：细胞凋亡内皮细胞T淋巴细胞P38MAPK
- 异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病患者血清组织因子、组织因子途径抑制因子的变化及其临床意义被引量：1
- 2009年
- 近年来组织凶子（TF）和生理性抑制剂组织因子途径（TFPI）在炎症反应、肿瘤迁移等非凝血功能方面表现出的重要作用得到许多学者的重视。现已发现，内皮损伤可能在器官移植后移植物抗宿主病（GVHD）的发生和发展中起重要作用。我们应用ELISA法检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）患者在移植前、后及发生GVHD的不同时段血清中TF、TFPI的水平变化，探讨TF、TFPI是否参与并影响了GVHD的病理过程，从而寻求预测GVHD发生、发展的有效检测指标。
- 郝琎琎李泉邹萍游泳夏凌辉黎纬明
- 关键词：组织因子途径抑制因子移植物抗宿主病移植后ELISA法检测TFPI
- 组织因子在移植物抗宿主病患者内皮损伤中的作用机制研究被引量：3
- 2009年
- 目的探讨组织因子（TF）在移植物抗宿主病（GVHD）血管内皮损伤中的作用及其机制。方法用实时定量PCR和Western blot方法检测TF在异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）和自体造血干细胞移植（auto-HSCT）小鼠各组织中基因和蛋白水平的表达。用流式细胞术、实时定量PCR和Western blot方法分别检测异基因CD4^＋或CD8^＋ T淋巴细胞对脐静脉内皮细胞（HUVEC）中TF、VCAM-1、TNF-α、IFN-γ、IL-6以及MAPK表达的影响，观察抗TF抗体、p38MAPK和JNK阻滞剂对异基因T淋巴细胞诱导的HUVEC中细胞因子表达的影响。结果①在allo—HSCT后发生GVHD小鼠的皮肤、胃、小肠和肝组织中，TF在基因水平的表达为对照组的（15．1±2．1），（5．5±1．4），（9．7±2．3），（14．3±2．9）倍，TF蛋白的表达水平分别为对照组的（13．5±2．7），（6．2±0．9），（7．9±1．6），（15．3±3．2）倍；②异基因T淋巴细胞可显著诱导HUVEC中TF、VCAM-1、TNF—α、IFN-γ和IL-6的表达；异基因T淋巴细胞作用后，HUVEC中p38MAPK和JNK磷酸化增强，而磷酸化ERK无变化。p38MAPK和JNK阻滞剂可显著降低异基因CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞诱导HUVEC的TF表达。抗TF抗体和p38MAPK、JNK阻滞剂均可下调异基因T淋巴细胞诱导的HUVEC中VCAM-1、TNF-α、IFN-γ和IL-6的表达。结论TF通过细胞内信号通路p38MAPK和JNK参与了GVHD导致的血管内皮细胞损伤和活化。
- 李泉张剑黎纬明邹萍
- 关键词：移植物抗宿主病T淋巴细胞血管内皮细胞丝裂原激活蛋白激酶类
- 转染组织因子胞内段siRNA阻抑人脐静脉内皮细胞凋亡的体外实验被引量：1
- 2010年
- 目的探讨转染组织因子胞内段小片段干扰RNA（siRNA）对血管内皮细胞凋亡的影响。方法体外设计组织因子胞内段siRNA I和siRNA II，插入质粒DNA后用脂质体将其转入人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）中。3组HUVEC分别转染siRNAI质粒（siRNA I组）、siRNA II质粒（siRNAII组）和pcDNA^TM 6．2GW／-miR质粒（对照组）。取各组HUVEC细胞，分别与CD8^＋T淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应。用流式细胞仪检测混合淋巴细胞反应中HUVEC的凋亡率，用磁珠法检测混合淋巴细胞反应上清液中活化部分凝血活酶时间（APTT）。结果插入的siRNA经过测序，证实为正确序列。HUVEC转染siRNA后24h及48h，siRNA I组和siRNA II组HUVEC的凋亡率均低于对照组（P〈0．01）。siRNAI组HUVEC的凋亡率低于siRNA II组（P〈0．05）。3组上清液的APTT较对照（RPMI1640培养基）缩短（4±0．46）s（P〈0．05）。siRNA I组和siRNA II组与对照组相比较，APTT的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论组织因子胞内段siRNA构建成功。转染该siRNA可在不影响凝血功能的情况下对混合淋巴细胞反应中的内皮细胞起到一定保护作用，减少内皮细胞的凋亡。
- 黎纬明韩红李泉周浩刘峥嵘葛超邹萍
- 关键词：凝血致活酶细胞内内皮细胞细胞凋亡小分子干扰
- 蛋白酶激活受体-1，2在小鼠急性移植物抗宿主病模型中的表达
- 2009年
- 目的研究蛋白酶激活受体-1，2（PAR-1，2）在小鼠急性移植物抗宿主病（aGVHD）模型中的表达。方法建立小鼠异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后aGVHD模型，并用同基因HSCT小鼠作为对照。观察小鼠aGVHD表现；实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白印迹和免疫组织化学法检测移植小鼠各种组织中PAR-1，2在基因和蛋白水平的表达。结果allo-HSCT小鼠在移植后18-28d出现了典型的aGVHD临床和病理表现。PAR-1基因在allo—HSCT组小鼠的皮肤、肝脏和小肠组织中的相对表达量较对照组显著增高（皮肤：0．039±0．013和0．008±0．002，P〈0．01；肝脏：0．165±0．084和0．017±0．006，P〈0．01；小肠：0．215±0．109和0．016±0．009，P〈0．01）；PAR-2基因在a11o-HSCT组小鼠的肝脏和小肠组织中表达较对照组增高（肝脏：0．010±0．003和0．003±0．002，P〈0．01；小肠：0．006±0．002和0．003±0．002，P〈0．05）；PAR-1，2基因在其余器官组织中的表达与对照组比较，差异无统计学意义。PAR-1，2在蛋白水平的表达与基因表达的检测结果一致。免疫组织化学染色显示PAR-1，2主要在aGVHD靶器官的上皮细胞和内皮细胞中表达增强。结论PAR-1，2表达增高很有可能参与异基因造血干细胞移植后aGVHD的病理生理过程。
- 李泉张剑邹萍黎纬明
- 关键词：急性移植物抗宿主病蛋白酶激活受体造血干细胞移植
