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人HVEM-Fc融合蛋白的制备及其生物学特性: 2013年; 为建立CHO/HVEM-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌HVEM-Fc融合蛋白,采用常规PCR法分别从本单位已构建的重组载体pGEZ-Term/B7-H1-Fc和pIRES2-EGFP/HVEM上扩增人IgG1(Fc)恒定区和人HVEM胞外段编码基因,XhoⅠ和Bam HI双酶切人IgG1(Fc)恒定区及真核表达载体pIRES2-EGFP,将两种酶切的目的产物连接为pIRES2-EGFP/Fc,同时将获得的人HVEM胞外段基因片段经XhoⅠ和NheⅠ酶切后插入上述pIRES2-EGFP/Fc构建成pIRES2-EGFP/HVEM-Fc重组载体,通过脂质体转染仓鼠卵巢癌CHO细胞,培养基中添加G418长期筛选并将分泌目的蛋白的基因转染细胞株亚克隆化。流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白的表达,收集含融合蛋白的基因转染细胞培养上清,Protein G亲和层析柱对其进行纯化,Western blot定性分析。MTT检测HVEM-Fc融合蛋白体外对抗人CD3单抗联合基因转染细胞L929/LIGHT刺激的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染细胞CHO/HVEM-Fc分泌的HVEM-Fc融合蛋白能与L929/LIGHT细胞有效结合,纯化后的蛋白经Western blot鉴定出现特异性清晰条带,并且HVEM-Fc融合蛋白对L929/LIGHT协同刺激的T细胞体外增殖具有抑制作用。; 黄子逸朱耿超王雪峰张学光; 关键词：融合蛋白共刺激分子 T细胞

人膜型HVEM对T细胞体外增殖和细胞因子分泌的协同刺激作用被引量：1: 2010年; 建立人协同刺激分子HVEM的基因转染细胞株,探讨膜型HVEM体外对T细胞活化与增殖的协同刺激作用。从此前已插入人HVEM编码区全长基因的pMD18-T/HVEM中用PCR法扩增出目的片段,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体构建成pIRES2-EGFP/HVEM重组载体,以脂质体法转染鼠L929细胞。经G418长期加压筛选,以免疫荧光标记和流式细胞术分析HVEM分子在转染细胞膜上的表达情况,以MTT法和ELISA法测定获得HVEM转染细胞L929体外对T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响。结果:基因转染细胞株L929/HVEM的细胞膜上能稳定高表达人HVEM分子。体外细胞共培养试验表明,与未转染HVEM基因的L929/mock细胞相比,L929/HVEM能显著地促进抗人CD3单抗(mAb)刺激的T细胞增殖,以及促进T细胞IL-2、IFN-γ、IL-10和TNF-α的分泌。建立了稳定高表达人HVEM分子的基因转染细胞株,并发现膜型HVEM体外对T细胞增殖和相关细胞因子的分泌具有显著促进作用。; 齐嫄王雪峰黄子逸朱耿超胡振华张学光; 关键词：HVEM 转染 T细胞增殖

人共信号分子HVEM在外周血PBMC表达特性及其对T细胞的生物学作用被引量：6: 2007年; HVEM既可作为受体与LIGHT作用传递正性共刺激信号,又能作为配体作用于BTLA介导负性共抑制信号。为深入探讨HVEM对T细胞复杂而又独特的调控作用,本文研究了HVEM在免疫细胞上的表达特性,初步探讨了T细胞表达的HVEM分子所介导的生物学作用。采用LPS刺激人新鲜PBMC,以及PHA或PMA/IM刺激活化T细胞;间接免疫荧光标记和流式细胞术检测HVEM表达;MTT法分析T细胞增殖作用。结果显示,HVEM在不同条件刺激活化的T细胞表面均呈现先上调后下调表达;T细胞增殖试验表明,基因转染细胞L929/LIGHT能够明显促进T细胞的增殖及IL-2和IFN-γ的分泌,而以抗人BTLA单抗在一定程度上模拟HVEM所介导的BTLA/HVEM信号能够明显抑制T细胞增殖作用及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10的产生。; 代群王雪峰陈永井王勤周迎会谢芳张学光; 关键词：HVEM BTLA 共刺激共抑制 T细胞

人BTLA-Fc融合蛋白的制备及其生物学活性的研究: 2011年; 为建立CHO/BTLA-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌BTLA-Fc融合蛋白,采用PCR法从本单位构建的pEGZ-Term/B7-H1-Fc重组质粒中扩增人IgG1(Fc)恒定区,Xho I、BamH I双酶切后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接为重组质粒pIRES2-EGFP-Fc,同时PCR法从pEGZ-Term/BTLA重组质粒中获得人BTLA胞外段基因片段,用Nhe I、Xho I双酶切插入上述pIRES2-EGFP-Fc构建重组载体pIRES2-EGFP/BTLA-Fc。脂质体法以该重组载体转染鼠CHO细胞,G418筛选并亚克隆化。Protein G亲和层析柱对上清中的融合蛋白进行纯化,Western blot作定性分析。CCK-8检测BTLA-Fc融合蛋白对抗人CD3单抗激发的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染CHO细胞培养上清中表达的BTLA-Fc融合蛋白能与L929/HVEM细胞有效结合,纯化的融合蛋白经Western blot鉴定有清晰的目的条带,而且BTLA-Fc融合蛋白对T细胞的体外增殖具有抑制作用。; 朱耿超黄子逸曹丽娟陈永井王雪峰张学光; 关键词：融合蛋白 T细胞

一株鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定被引量：4: 2007年; 为了研制鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体,以高表达人BTLA分子的基因转染细胞L929/BTLA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以基因转染细胞293T/BTLA和293T/mock作为抗原,筛选阳性杂交瘤克隆,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复鉴定和多次克隆化培养,筛选获得分泌特异性鼠抗人BTLA分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、细胞核染色体计数、竞争结合抑制试验和T增殖抑制试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果表明,成功获得一株持续、稳定分泌鼠抗人BTLA单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H9,该单抗可特异性识别基因转染细胞以及静止与活化T淋巴细胞上表达的BTLA分子,单抗8H9和BTLA交联后能显著抑制鼠抗人CD3单抗对T细胞激发的增殖作用。; 王雪峰陈永井王勤代群杨科芳张学光; 关键词：BTLA 单克隆抗体杂交瘤

人LIGHT基因转染细胞株的建立及其对T细胞协同刺激作用的研究被引量：2: 2010年; 建立人协同刺激分子LIGHT的基因转染细胞株,探讨其体外对T细胞活化与增殖的协同刺激作用。采用RT-PCR法从活化的人外周血T细胞中克隆人LIGHT编码区全长基因,经EcoR I和BamH I双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体构建成pIRES2-EGFP-LIGHT重组子,脂质体法以重组质粒pIRES2-EGFP-LIGHT转染鼠L929细胞。经G418长期加压筛选,免疫荧光标记和流式细胞术分析LIGHT分子在基因转染的L929细胞膜上的表达,MTT法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)探讨获得的基因转染细胞L929/LIGHT体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测转基因L929/LIGHT细胞膜上能稳定高表达人LIGHT分子。体外细胞共培养试验表明,与未转染LIGHT基因的L929/mock细胞相比,L929/LIGHT能显著地促进抗人CD3单抗(mAb)刺激的T细胞增殖;同时L929/LIGHT亦能明显促进T细胞对IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌。建立了稳定高表达人LIGHT分子的基因转染细胞株,LIGHT介导的信号在体外对T细胞增殖和相关细胞因子的分泌具有显著地促进作用。; 黄子逸王雪峰齐嫄朱耿超胡振华张学光; 关键词：T细胞

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国家自然科学基金(30600548)