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扇棘单睾吸虫Real-time PCR与常规PCR检测方法的建立: 2015年; 根据扇棘单睾吸虫核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列,应用Primer premier 5.0软件自行设计一对可同时应用于real-time PCR和常规PCR的特异引物,建立real-time PCR与常规PCR鉴定扇棘单睾吸虫的方法,评估其特异性及灵敏性。应用建立的方法鉴定犬猫内脏中收集的吸虫,并用测序进行验证,检验方法的准确性和实用性。结果表明,建立的两种方法均只能特异性扩增扇棘单睾吸虫目的片段,不与横川后殖吸虫、钩棘单睾吸虫、华支睾吸虫、瓦氏瓦特松吸虫、棘口属吸虫、背孔属吸虫、心形咽口吸虫、野牛平腹盘吸虫、东方次睾吸虫、卫氏并殖吸虫、异尖属线虫、宫脂属线虫发生交叉扩增;敏感性试验表明,real-time PCR和常规PCR检测扇棘单睾吸虫质粒的最低检测限分别为43拷贝和86拷贝。建立的realtime PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.998)。鉴定来自犬猫的吸虫17条,结果显示两种方法均能准确鉴定出扇棘单睾吸虫。; 李树清梅雪芳林颖峥石云良黄腾飞王巧全张强陈志飞宋青唐智芳黄维义; 关键词：实时荧光定量PCR 常规PCR

多重PCR鉴定三种颚口线虫方法的建立被引量：4: 2014年; 为了建立快速、灵敏、可靠的鉴别颚口线虫虫种的方法,根据GenBank中发表的棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫ITS-2序列,设计了3对特异引物,建立了这3种颚口线虫的单一PCR和多重PCR检测方法,并分别对单一PCR和多重PCR方法的特异性和敏感性进行了鉴定。结果显示单一PCR和多重PCR均能特异扩增出棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫,其片段大小分别为282、358、183 bp,单一PCR对棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫虫体DNA最小检出量分别为0.2、0.01、0.01 ng/μL。对宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫以及迭宫绦虫均不能进行扩增。用建立的多重PCR方法对菲律宾、印度尼西亚、黑龙江颚口线虫等12条颚口线虫DNA模板进行扩增,经鉴定菲律宾与印度尼西亚的颚口线虫为棘颚口线虫,黑龙江的颚口线虫为日本颚口线虫。鉴定结果与原虫体样本的形态鉴定和测序分析结果一致。研究显示建立的多重PCR方法具有很强的特异性和较高的敏感性,可用于棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫虫种的鉴定和流行病学调查。; 李树清李雯雯张鸿满陈韶红李健陈志飞王巧全张永年黄维义; 关键词：棘颚口线虫多重PCR 虫种鉴定

入境黄鳝颚口线虫检疫及虫种鉴定被引量：11: 2011年; 目的检查进口黄鳝（Monopterus albus）体内的颚口线虫Ⅲ期幼虫,并鉴定虫种。方法对2010年1月至2011年3月间从上海口岸入境的10批黄鳝进行颚口线虫寄生情况检疫。采样52尾,3-10尾/批,分别来自菲律宾（25尾）、印度尼西亚（24尾）和孟加拉国（3尾）,分尾解剖、切碎、蛋白酶消化后,悬液用10目铜筛过滤,取滤液沉淀。体视镜下挑出完整虫体,进行形态学鉴定,并计算感染率和感染度。提取颚口线虫基因组DNA,PCR扩增核糖体DNA第二内转录间隔区（internal transcribed spacer region 2,ITS2）和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochromec oxidase subunit 1,cox1）基因,对产物进行电泳和测序。测序结果与GenBank相应序列进行多重序列比对。结果从菲律宾和印度尼西亚进口的黄鳝中均检出有颚口线虫Ⅲ期幼虫寄生,阳性率分别为36.0%（9/25）和50.0%（12/24）,平均感染度分别为7.8（70/9）和2.8（34/12）。孟加拉国进口的黄鳝采样中未检出虫体。镜下显示,检获的虫体有头球,头球上有4环小钩,体表有横纹和小棘,体前部棘明显大而密,体后部棘渐小而疏。有1对颈乳突和4个颈囊。形态学特征与棘颚口线虫（Gnathostoma spinigerum）Ⅲ期幼虫相似。PCR结果显示,ITS-2和cox1扩增产物的长度分别为647 bp和441 bp,与预期大小一致。经测序后比对分析结果显示,2个扩增产物分别与棘颚口线虫ITS-2（GenBank登录号为AB181155和Z97175）和cox1（GenBank登录号为AY501388、AB180099和AB551552）基因片段序列一致性为99%~100%。结论从菲律宾和印度尼西亚进口黄鳝中检出的颚口线虫均为棘颚口线虫。; 李树清李雯雯陈志飞李健陈韶红张永年黄维义王巧全; 关键词：棘颚口线虫黄鳝虫种鉴定

横川后殖吸虫与扇棘单睾吸虫双重PCR鉴别方法的建立被引量：1: 2015年; 目的建立一种能快速鉴定横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawai)和扇棘单睾吸虫(Haplorchis taichui)的双重PCR方法。方法从Gen Bank中获取横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫以及与其同源性较高的虫种的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列,应用Primer premier 5.0软件设计2对特异性引物,并优化PCR反应体系和反应条件,建立双重PCR法。将横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫与17个相关虫种一起进行PCR扩增,检测方法的特异性。横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的ITS1扩增产物经p MD19-T载体进行TA克隆获得质粒,并将质粒进行梯度稀释,检测其敏感性。应用新建的双重PCR法鉴定从47副猫内脏和40副犬内脏中收集的吸虫,检测该方法的准确性和实用性。结果新建的双重PCR法能扩增出横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的目的片段,大小分别为648 bp和279 bp,不与钩棘单睾吸虫、华支睾吸虫、心形咽口吸虫、次睾属吸虫囊蚴、外睾属吸虫囊蚴、藐小棘隙吸虫、抱茎棘隙吸虫、弗氏棘口吸虫、似锥低颈吸虫、全冠属吸虫、重盘属吸虫、异尖属线虫、东方次睾吸虫、卫氏并殖吸虫、瓦氏瓦生吸虫、背孔属吸虫和宫脂属线虫的DNA发生交叉扩增,具有较好的特异性。敏感性试验表明,应用该双重PCR法,2类吸虫DNA的最低检测值分别为1.49×10-1pg和1.14×10-1pg。对来自猫内脏和犬内脏的吸虫检测表明,该方法能够区分横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫,并且不与猫、狗中其他的吸虫DNA发生交叉扩增。结论本研究所建立的双重PCR法可用于快速鉴定横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫。; 梅雪芳李树清康羊群石云良黄腾飞陈志飞黄维义; 关键词：双重PCR

Molecular identification and phylogenetic analysis of plerocercoid in snakes from Guilin city: To study the taxonomy position of plerocercoid from Flower-waved snake in Guilin city,the nuclear 18S rDNA、28S...; Li Wenwen~1,Li Jian~1,Li Shuqing~(2*),Zhang Hongman~3,Huang Weiyi~1 1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Guangxi,Nanning,53000S,China; 文献传递

黑龙江与广州颚口线虫幼虫分离株的形态学观察及其分子鉴定被引量：8: 2012年; 本研究从来自黑龙江及广州地区的泥鳅中分离到10条颚口线虫幼虫,采用光学显微镜观察幼虫的形态特征,并对虫体的ITS2与CO1基因进行扩增测序、系统发育分析以鉴定虫种。结果显示10条颚口线虫幼虫头球均有3环小钩,其形态学特征与日本颚口线虫(Gnathostoma nipponicum)第3期幼虫相符。序列分析结果显示与GenBank中登录的日本颚口线虫ITS2和CO1基因的同源性分别为100%和99%。邻位连接法构建的50%一致树也均与日本颚口线虫处于同一分支。表明从黑龙江及广州地区泥鳅中分离的颚口线虫幼虫为日本颚口线虫幼虫,首次证明了中国存在日本颚口线虫。; 李雯雯李树清张子群李健陈志飞王艳黄维义; 关键词：泥鳅

钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列测定及其种系发育分析被引量：2: 2015年; 本试验将从犬猫肠道中分离的钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫用盐酸卡红染色后观察其形态学特征;PCR扩增其ITS2基因序列并测序,并将测序结果与GenBank同属异形科的多棘单睾吸虫和横川后殖吸虫序列进行比对;应用Mega 6.05软件采用邻位相连法构建种系发育树进行分析。盐酸卡红染色后显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫各形态学特征符合经典的分类学描述。PCR测序后获得钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列长度分别为295和297bp,G＋C含量分别为49.5%（146/295）和54.2%（161/297）。提交至GenBank后获得登录号分别为钩棘单睾吸虫KJ137221-KJ137223,KP165437-KP165439;扇棘单睾吸虫KP165440。序列比对结果显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫种内差异性为0,4种异形吸虫种间差异为15.2%-28.9%。基于ITS2序列建立的种系发育树显示钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫构成自展值为78%的拓扑分支。; 梅雪芳李树清胡长红黄腾飞陈志飞黄维义

横川后殖吸虫与扇棘单睾吸虫二重PCR鉴别方法的建立: 目的建立一种能快速鉴定横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的二重PCR方法.方法从GenBank中获取横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫以及与其同源性较高的虫种的ITS1序列,应用Primer premier 5.0软件设计两对特异性...; 梅雪芳李树清康羊群石云良黄腾飞陈志飞黄维义; 关键词：二重PCR

桂林蛇源裂头蚴分离株的分子鉴定及种系发育关系分析被引量：10: 2011年; 为研究从桂林草花蛇中分离到的裂头蚴的分子分类地位,对其核糖体18SrDNA、28SrDNA、ITS全基因及线粒体cox1部分基因进行了克隆和序列分析。从GenBank获取相应基因序列,应用CLUSTAL W2软件进行多重比对分析序列差异,应用MEGA 4.0软件构建种系发育树。结果表明,在基于18S、28S基因序列构建的种系发育树中,本株裂头蚴分别与欧猥迭宫绦虫(D64072)18S构成一个单独分支,自展值为100%;与拟曼迭宫绦虫(AF004718)、欧猥迭宫绦虫(AF004717)、无头蚴绦虫(AF096223)28S同属一个分支,自展值61%。基于ITS1、ITS2和cox1部分基因序列构建的种系发育树与所有欧猥迭宫绦虫均构成同一亚群,总分支自展值分别为100%、99%、64%,三者在不同的分离株之间呈现基因多态性,从总分支自展值来看cox1比ITS更适合用于种内遗传多态性研究,ITS适合做定种的分子标记。; 李雯雯李健李树清张鸿满黄维义; 关键词：裂头蚴小亚基大亚基内转录间隔区

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国家质检总局科技计划项目(2010IK013)

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