国家科技重大专项(2008ZX10002-011)
- 作品数：26 被引量：105H指数：6
- 相关作者：徐东平刘妍钟彦伟杨东亮许智慧更多>>
- 相关机构：解放军第302医院华中科技大学同济医学院附属同济医院解放军302医院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项北京市自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 乙型肝炎病毒rtN238H变异与阿德福韦酯耐药的相关性研究被引量：2
- 2011年
- 目的阐明乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶/逆转录酶区rtN238H变异对临床产生阿德福韦(ADV)耐药的影响。方法分析了1789例慢性乙型肝炎患者rtN238H变异的发生频率及其与ADV用药的关系;从典型病例患者血清中克隆获得HBV rtN238H变异株并通过回复定点突变获得对应的野生株,分别构建pTriEx-HBV1.1重组表达载体,瞬时转染HepG2细胞。给予转染细胞不同浓度ADV处理,用DNase消化游离DNA后,对上清中成熟病毒颗粒中的HBV DNA进行裂解定量以评价病毒的复制力。结果在1789例乙型肝炎患者中rtN238H变异为181例(10.1%),其中HBV B基因型感染为151例(83.4%),C基因型感染为30例(16.6%);ADV经治和未治患者分别为130例(71.8.%)和51例(28.2%),其中对ADV治疗产生临床应答(含部分应答)的占82.3%(107/130),无应答或出现病毒学反跳的占17.7%(23/130),但与野生株相比,rtN238H变异株对ADV的敏感性和病毒复制力无明显的改变。结论 rtN238H是HBV自然发生的多态性变异,对ADV敏感性和复制力无直接的影响。
- 朱华钟彦伟许智慧刘佳慧刘妍苏何玲徐东平
- 关键词：慢性乙型肝炎乙型肝炎病毒耐药性阿德福韦
- 滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用被引量：15
- 2009年
- 目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链结合。在Phi29DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较。结果成功建立了HBVcccDNA全序列的RCA方法,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列。27例患者中,18例患者的肝组织cccDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变。结论滚环扩增方法对肝组织HBVcccDNA的检测具有较好的灵敏度。该方法的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义。
- 任晓强苏何玲邹正升高峰刘立明刘妍李保森徐东平钟彦伟
- 关键词：滚环扩增共价闭合环状DNA
- 不同种小鼠乙型肝炎模型的建立及其感染状况研究被引量：3
- 2017年
- 目的探讨建立急性或慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型的方法。方法采用高压尾静脉注射p AAV/HBV1.2表达质粒,建立急性或慢性HBV感染小鼠模型,采用ELISA法检测HBV抗原,采用RT-PCR法检测免疫相关分子基因,使用FACS检测肝内淋巴细胞活化情况,采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)法检测脾脏相关免疫细胞特征。结果成功建立急性和慢性高压尾静脉注射HBV感染小鼠模型;在急性BALB/c小鼠模型,血清HBs Ag持续时间分别为(3.25±1.04)w,显著短于慢性C57BL/6小鼠组【(10.0±3.74)w,P<0.05)】;在BALB/c小鼠模型,注射2.5μg病毒质粒小鼠血清HBs Ag持续时间为(3.67±1.03)w,显著长于注射50μg组【(2.33±0.52)w,(P<0.05)】;在高压尾静脉注射后第10 d,BALB/c小鼠脾脏出现了HBc Ag特异性T淋巴细胞。结论成功建立高压尾静脉注射HBV感染小鼠模型,发现宿主遗传背景、免疫应答状态和病毒剂量影响HBV感染小鼠模型的建立。
- 周云李盛唐宗生杨东亮宋景娇
- 关键词：乙型肝炎小鼠
- 一种新的HBV表型耐药研究方法的建立
- 2013年
- 目的:探索建立一种快速、简便、经济的HBV表型耐药分析方法。方法:将野生型pTriEx-HBV1.1表达载体转染HepG2细胞,5h后给予不同浓度的LAM、ADV及ETV处理,隔天换药1次,换药2d后收集培养上清及细胞,用Dnase处理后,real-timePCR检测HBVDNA的水平。结果:上清及细胞内核心颗粒HBVDNA的水平下降2～3个数量级,最大抑制率达98%,EC50值接近。结论:以上清病毒定量代替核心颗粒,建立了基于real-timePCR的HBV表型耐药分析方法,有利于HBV临床治疗的耐药监测。
- 朱华苏何玲刘永明刘青波马义丽许智慧钟彦伟徐东平
- 关键词：肝炎病毒乙型REAL-TIME
- G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究被引量：6
- 2010年
- 目的构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBVCP变异对下游基因转录活性的影响。方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVCP片段,克隆至pGEM-TEasy载体。挑选含有CP相关变异位点的质粒,经KpnⅠ/BglⅡ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测。结果患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05)。细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍。结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBVCP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用。
- 王耀刘妍许智慧纪冬李晓东钟彦伟徐东平
- 关键词：突变启动区反式激活
- 影响慢性乙型肝炎病毒感染者临床结局的病毒学因素研究进展被引量：3
- 2012年
- 慢性乙型肝炎患者临床结局受多种因素的影响,主要包括宿主因素和病毒学因素两大方面,其中病毒学因素包括HBVDNA载量,HBV基因型、HBV基因变异及HBV蛋白表达等。本文就影响慢性乙型肝炎病毒感染者临床结局的病毒学因素研究进展进行了介绍。
- 徐春利郝友华杨东亮
- 关键词：慢性乙型肝炎病毒学
- 乙型肝炎病毒polyA形成与调节因素研究进展
- 2011年
- 乙型病毒性肝炎（乙肝）是全球范围的重大公共卫生问题之一,其病原体乙型肝炎病毒（HBV）可通过多种途径感染人体,引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HBV感染是全球十大死因之一,世界上30%的人感染过或者成为HBV的携带者。据统计[1],全球共有3.5亿HBV慢性感染者,每年因HBV慢性感染所致的肝纤维化或者肝癌感染致死的人数有100万左右。
- 关武祥杨东亮
- 关键词：乙型肝炎病毒
- 喜马拉雅旱獭血液生理指标测定被引量：8
- 2010年
- 首次测定了45只人工饲养条件下喜马拉雅旱獭的血液生理值。结果显示人工饲养条件下除淋巴细胞和中性粒细胞百分率因动物年龄不同而有显著性差异外(P<0.05),不同性别、不同饲养时间喜马拉雅旱獭的白细胞数、白细胞分类计数百分率、红细胞、血小板、血红蛋白和平均血红蛋白浓度等7项指标都没有显著性差异,说明建立的旱獭人工饲养管理方法可保证动物的血液生理指标的稳定性,所测血液生理指标也可作为喜马拉雅旱獭饲养管理和疫病检测判断的参考依据。
- 陶元清范微王忠东王宝菊
- 关键词：喜马拉雅旱獭血液生理指标
- 表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建被引量：6
- 2010年
- 目的构建表达针对HBsAg小发卡RNA(shRNA)的重组腺相关病毒载体,以观察该病毒在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将表达针对HBsAg的shRNA定向克隆到pAAV/U6-hrGFP质粒中,获得重组表达质粒(pAAV-shHBs-hrGFP);采用磷酸钙转染法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染AAV293细胞,进行rAAV-shHBs-hrGFP重组病毒包装。收获病毒感染HepG2.215细胞;采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平。结果酶切鉴定、测序结果表明,pAAV-shHBs-hrGFP载体成功构建。包装收获的rAAV-shHBs-hrGFP病毒液可以感染HepG2.215细胞,并且可以抑制HBsAg和HBeAg的表达。结论制备的rAAV-shHBs-hrGFP病毒载体能够抑制HBV在体外的抗原表达。
- 胡斌杨燕刘嘉马智勇黄红平余源刘慎沛杨东亮
- 关键词：RNA干扰HBSAG
- 一种HBV研究的新动物模型-喜马拉雅旱獭β-actin基因的克隆及序列分析被引量：5
- 2011年
- 目的 喜马拉雅旱獭对土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）高度易感,可作为HBV感染的新动物模型.本研究对喜马拉雅旱獭β肌动蛋白（β-actin）的部分cDNA序列进行了克隆和序列分析,为喜马拉雅旱獭在HBV感染研究中的应用奠定基础.方法 根据Genbank的土拨鼠β-actin cDNA的序列设计特异性引物,提取旱獭脾组织总RNA作为模板,RT-PCR扩增旱獭β-actin cDNA序列;PCR产物纯化后连接至T载体（pMD18-T）,构建重组质粒pMD18-T-mhActin.对重组质粒进行PCR初筛及酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对所获得的序列进行同源性和种系进化分析.结果 获得的旱獭β-actin序列为349 bp（nt887～1 235）,其中编码序列为323 bp（nt-887～1209）,编码106个氨基酸,包含形成二硫键的2个丝氨酸位点（氨基酸16和氨基酸105）及与β-actin功能相关的2个ATP结合位点、6个凝溶胶蛋白结合位点和6个profilin结合位点.同源性分析发现上述序列与其它哺乳动物β-actin的同源性均高达88 %以上,与土拨鼠β-actin的同源性最高（99.69 %）,其氨基酸序列的同源性为100 %.种系进化树分析提示喜马拉雅旱獭β-actin与土拨鼠β-actin的亲缘关系最近,其次为其它啮齿类动物.结论 成功克隆了喜马拉雅旱獭β-actin的部分序列.序列分析发现喜马拉雅旱獭β-actin与土拨鼠β-actin的同源性最高.
- 冯雪梅尹莹李安意朱珍妮陶元清王忠东陆蒙吉杨东亮王宝菊
- 关键词：乙型肝炎病毒喜马拉雅旱獭肌动蛋白
