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The Leu477 and Leu613 of ORF2-Encoded Protein Are Critical in Forming Neutralization Antigenic Epitope of Hepatitis E Virus Genotype 4被引量：10: 2008年; Hepatitis E virus (HEV) genotype 4 was originally identified in China. Its neutralization antigenic epitopes have not been characterized. Recently, we identified a neutralizing monoclonal antibody (mAb) 1G10, which was generated following immunization of mice with p166Chn, a recombinant protein comprising 464-629 amino acids (aa) of the HEV genotype 4 capsid protein. In this study, a panel of 22 N- and/or C-terminal truncated and 6 site-directed mutated p166Chn proteins were prepared. Only those N- or C-terminal truncated proteins containing the region 477-613 aa could react with the mAb 1G10, suggesting the neutralization epitope of HEV genotype 4 is located between aa477 and aa613. However, a both N- and C-terminal truncated protein, pN477-C613, neither reacted to 1G10 nor elicited neutralizing antibodies in mice, while another both terminal truncated protein, pN472-C617, did, suggesting the flanking regions of the pN477-C613 could help to stabilize and allow presentation of the neutralization epitope to the immune system. Substituting Leu477 and/or Leu613 with the polar, uncharged threonine (Thr) caused ≥ 50% reduction of the mutants' immunoreactivity to 1G10, whereas replacement by hydrophobic phenylalanine (Phe) made little impact on the immunoreactivity, revealing functional associations between hydrophobicity of aa at positions 477 and 613 and the antigenicity of p166Chn. These data suggested Leu477 and Leu613 are critical in forming the neutralization epitope of HEV genotype 4.; Hongmei ZhangXing DaiXiangnian ShanJsihong Meng; 关键词：遗传基因

戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定及基因型分型被引量：8: 2004年; 目的　检测戊型肝炎病毒 (HEV)摩洛哥株非编码区 (UTR)序列 ,探讨HEV非编码区序列能否作为其基因型分型的依据。方法　使用基于RNA连接酶的cDNA末端快速扩增法 (RLM RACE)扩增HEV摩洛哥株 5′和 3′端片段并测序。所得序列使用LASERGENE和PHYLIP软件包与其他 2 9株HEV序列比较。结果　只有基于甲基化帽子结构的RLM RACE扩增出了 5′端片段。HEV摩洛哥株 5′端UTR有 2 6个核苷酸 ,3′端polyA之前有 6 5个核苷酸。基于 3′端UTR序列的进化树与基于全基因序列的进化树不全相同。HEV 3′端至少需要 10 0个左右核苷酸长的序列才可进行HEV基因型分型。结论　HEV摩洛哥株 5′端有甲基化帽子结构。HEV 3′端UTR序列不能完全代替全基因组序列进行基因型分型。部分序列替代全基因组进行基因型分型时需要考虑其部位和长度因素。; 陈国兵孟继鸿; 关键词：HEV 戊型肝炎病毒非编码区 CDNA末端快速扩增进化树

用不同基因型戊型肝炎病毒重组蛋白建立酶联免疫吸附测定一步法被引量：3: 2009年; 目的以7种不同基因型和亚型的HEV重组蛋白作为包被抗原，建立HEV抗体检测EuSA一步法。方法通过方阵滴定法确定包被抗原浓度，确定临界值，并进行敏感度、特异度和热稳定性试验。结果7种重组抗原混合物（Mix166）最佳包被浓度为1．5mg／L。抗-HEV IgG检测试剂的批内、批间变异系数分别为8．67％和10．85％，抗一HEV IgM检测试剂的批内、批间变异系数分别为4．56％和5．99％。一步法检测50份HEV RNA阳性血清的HEV IgG和HEV IgM抗体，阳性率均为94％。一步法检测674份健康者血清，52份抗-HEVIgG阳性．3份抗HEV IgM阳性。一步法检测HEV墨西哥株攻击黑猩猩后收集的系列血清发现，病毒攻击后1～6周抗-HEVIgM阳性，2～76周抗-HEV IgG阳性，而进口试剂盒缺乏对抗-HEV墨西哥株IgG、IgM的反应性。结论Mix166作为包被抗原建立的HEV抗体ELISA一步法具有较好的敏感性和特异性，可用于HEV感染的诊断。; 周镇先丁福董晨龚希平耿全林孟继鸿; 关键词：酶联免疫吸附测定基因型

骨髓基质细胞-成骨细胞复合培养体系的建立被引量：2: 2013年; 背景:在骨修复和重建过程中,成骨细胞和骨髓基质细胞是主要功能细胞,二者存在着密切的功能联系。目的:通过骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系的建立,观察共育体系中两种细胞之间的功能影响及生物学特点。方法:原代分离人骨髓基质细胞和人成骨细胞,将2种细胞置于Transwell共育环境中共同培养,建立人骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系。分别采用MTT、丫啶橙染色、碱性磷酸酶活性检测等方法初步评价共育体系中两种细胞增殖、凋亡及功能改变情况。结果与结论:在复合培养体系中,骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系能够促进成骨细胞的增殖与碱性磷酸酶的活性,同时抑制骨髓基质细胞的凋亡,促进骨髓基质细胞的趋化聚集。结果提示在复合培养体系中,骨髓基质细胞能够加速成骨细胞的增殖及成骨活性,另外成骨细胞也可减少骨髓基质细胞的凋亡,并加强其成骨性分化的作用。两者之间具有较为紧密的影响和功能联系。; 杨春露赵勇陈建庭; 关键词：干细胞骨髓干细胞骨髓基质细胞成骨细胞骨再生

戊型肝炎病毒Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ基因型B细胞抗原表位的异同被引量：11: 2004年; 目的 :制备戊型肝炎病毒 (HEV)缅甸株和墨西哥株ORF2重组蛋白 (p16 6Bur和p16 6Mex)的单克隆抗体(McAbs) ,用于分析HEV不同基因型B细胞抗原表位的特点。方法 :将免疫BALB C小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合 ,获得分泌抗 p16 6Bur和抗 p16 6MexMcAbs的杂交瘤细胞株 ,然后采用ELISA和免疫印迹法测定McAbs与不同基因型HEVORF2编码蛋白p16 6的免疫反应性。结果 :获得 4株杂交瘤细胞株 ,即分泌抗 p16 6BurMcAbs的 2C2 、2B1 以及分泌抗 p16 6MexMcAbs的D8G1 0 和E5E1 2 ,其中 2B1 分泌的McAb仅能与第Ⅰ、Ⅱ基因型编码的重组蛋白结合 ,而其余 3株分泌的McAbs既能与I、II基因型HEV的p16 6重组蛋白发生反应 ,也能与III、IV基因型的p16 6蛋白反应。结论 :HEV第Ⅰ、Ⅱ基因型与Ⅲ、Ⅳ基因型ORF2编码蛋白既有共同又有不同的B细胞抗原表位。; 赵宇梁久红孟继鸿张兰芳张红梅丁福季晓辉; 关键词：戊型肝炎病毒抗原表位单克隆抗体重组蛋白基因型

不同基因型戊型肝炎病毒的抗原表位分析被引量：14: 2003年; 目的　研究不同基因型戊型肝炎病毒 (HEV)的抗原表位特点。方法　以HEV基因工程重组蛋白p16 6Bur、p16 6Mex为免疫原 ,制备单克隆抗体 (McAbs)。采用间接ELISA法及免疫印迹法(Westernblot) ,检测所制备的McAbs与 7种不同基因型和亚型p16 6 (p16 6Bur、p16 6Pak、p16 6Mor、p16 6Mex、p16 6Us、p16 6Nz和p16 6Chn)的交叉反应性。结果　获得 4株稳定分泌基因型相关McAb的杂交瘤细胞株 ,即 1B5、1D1 0 、1G1 0 和D4 A3。经检测 ,1B5、1D1 0 、1G1 0 分泌的McAbs只与p16 6Bur及p16 6Mor特异结合 ,D4 A3分泌的McAb只与p16 6Mex特异结合。结论　不同基因型HEV存在不同的抗原表位。; 梁久红孟继鸿赵宇戴星丁福张兰芳; 关键词：不同基因型戊型肝炎病毒抗原表位单克隆抗体免疫印迹法 ELISA法

戊型肝炎病毒第Ⅳ基因型特异性抗原表位的鉴定与定位被引量：2: 2006年; 目的研究戊型肝炎病毒(HEV)第Ⅳ基因型巾国株开放阅读框架(ORF)2编码蛋白p166Chn的抗原表位特征。方法制备HEV ORF2重组衣壳蛋白p166Chn的特异性单克隆抗体(McAb)．进行中和活性鉴定,并利用7种HEV不同基因型p166重组蛋白以及22种N端或C端逐步截短的p166Chn进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测,确定McAb所识别抗原表位的性质和位置。结果获得1株稳定分泌HEV McAb的杂交瘤细胞株,命名为B_4。该McAb不与其他基因型p166重组蛋白反应,不能中和HEV对培养细胞的感染性,也不能竞争抑制已知中和性McAb与抗原p166Chn的结合,表明McAb B_4所针对的抗原表位是HEV第Ⅳ基因型特异的非中和性抗原表位。此外,McAb B_4能与截短蛋白pN452、pN460、pN462、pN463、pN464、pN465、pN466、pN468、pN470和pN472发生阳性反应,而与pN482、pN492、pC587、pC597、pC599、pC600、pC601、pC603、pC605、pC607、pN465- C601和pN460-C605均不反应。表明其可识别的抗原表位位于472～617位氨基酸,而且N端第472～482位氨基酸以及C端第607～617位氨基酸的1个或多个氨基酸对构成该抗原表位起着重要作用。结论所发现的HEV第Ⅳ基因型特异性抗原表位是1个非中和性的构象依赖性表位,可定位于pORF2的第472～617位氨基酸。; 汪源梁久红董晨田华戴星赵宇孟继鸿; 关键词：戊型肝炎病毒抗原表位单克降抗体基因型

PCR结合单酶切对戊型肝炎病毒进行基因分型的研究被引量：5: 2005年; 目的　建立PCR结合单酶切对戊型肝炎病毒(HEV)进行基因分型的方法,并将其应用于HEV基因型分布的研究。方法　采用简并引物扩增1～4型HEVORF1片段,1、2型HEVPCR产物为2 75、2 6 9bp ,3、4型PCR产物为317、314bp ,分别应用NaeⅠ、NotⅠ消化两种长度的PCR产物,根据酶切结果区分4种基因型。结果　采用此方法对4种基因型的HEV标准株分型,结果与预期一致;4 3份HEVIgM阳性的临床标本中,19份PCR阳性,分型结果均为4型HEV。结论　此方法可以快速简便地区分HEV 4种基因型。南京地区散发戊型肝炎大多由4型HEV所致。; 潘宁戴星孟继鸿刘社兰; 关键词：戊型肝炎病毒基因分型酶切 IGM阳性分型结果标准株

不同剂量配比的实验性甲型肝炎戊型肝炎联合疫苗的免疫原性研究被引量：1: 2007年; 目的研究实验性甲型肝炎(甲肝)戊型肝炎(戊肝)联合疫苗的免疫原性,探讨两种抗原组分间的相互作用。方法制备9种不同剂量配比的实验性甲戊肝联合疫苗,与单价疫苗对照一起免疫15组(共120只)小鼠,定时采血,以ELISA和中和试验检测抗HAV和抗HEV的抗体。结果高剂量的HAV抗原(5×105U/L)与不同剂量的HEV抗原(200、100、50mg/L)配制的联合疫苗,诱导的抗HAV中和抗体的滴度可达1∶1024,含25×104、125×103U/LHAV抗原的联合疫苗诱导的中和抗体滴度为1∶512,不同剂量的HEV抗原对抗HAV中和抗体的产生均无明显影响。与单价戊肝疫苗相比较,联合疫苗诱导的抗HEV抗体水平均有明显升高,且随联合疫苗中HAV抗原的含量(5×105、25×104、125×103U/L)的增加而升高,HEV抗原的剂量在一定范围内(200、100、50mg/L)与抗HEV抗体产生无明显关系。采用基于逆转录套式PCR的中和试验表明,各联合疫苗组的免疫血清均可中和HEV。结论实验性甲、戊肝联合疫苗内HAV抗原对HEV抗原的免疫原性具有增强作用,而HEV抗原对HAV抗原的免疫原性无明显影响。; 董晨戴星孟继鸿; 关键词：甲型肝炎病毒戊型肝炎病毒联合疫苗免疫原性

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨被引量：5: 2004年; 目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区域最小自由能与RT nPCR扩增效率的关系。结果 :4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段 ,但得到的PCR滴度有差异 ,D组引物所得滴度最高 ,B组最低 ;5 4份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低 ,B组的最高 ,与PCR扩增效率相关。结论 :在HEV基因组第 62 96～ 660 3核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本 ,扩增效率高。; 周镇先戴星孟继鸿; 关键词：基因型戊型肝炎病毒基因组

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