国家自然科学基金(30271236)
- 作品数：22 被引量：75H指数：5
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- DA与Lewis大鼠品系组合建立大鼠肝移植排斥与耐受模型
- 2008年
- 目的建立大鼠原位肝脏移植急性排斥与自然耐受模型。方法采用近交系雄性DA大鼠与Lewis大鼠互为供受体，改良“二袖套”法建立大鼠原位肝脏移植（rat orthotopic liver transplantation，ROLT）模型84例。实验分为4组：排斥组（DA→Lewis，n=12），FK506处理排斥组EDA—Lewis．n=24，术后1～7d用FK506 0．2mg／（kg·d）灌胃]，耐受组（Lewis→DA，n=24），同基因组（DA—DA，n=24）。各组中随机取6例观察生存期，其余分别于术后7、14、28d处死6例，收集外周血及肝脏标本。检测血清标本天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）浓度，病理学检查移植物排斥反应程度。结果排斥组中位生存时间（median survivaltime，MST）为12d，而FK506处理排斥组MST为76d，较排斥组明显延长（vs排斥组，P〈0．01）。耐受组与同基因组的MST均〉120d。术后7d，排斥组血清AST、BILI浓度均明显高于其余3组（P〈0．05）；术后14d，FK506处理组、耐受组和同基因组血清AST、TBIL浓度无明显差异。术后28d，FK506处理组血清AST、TBIL浓度较耐受组和同基因组明显升高（P〈0．05）。肝脏病理表现：术后7d，排斥组为严重的急性排斥反应，Banff评分Ⅲ级；耐受组为Ⅰ～Ⅱ级，同基因组与FK506处理排斥组为0～Ⅰ级。术后28d，FK506处理排斥组为慢性排斥反应表现，耐受组和同基因组移植无明显排斥反应表现。结论DA与Lewis大鼠品系组合，可以建立稳定可靠的肝脏急性排斥模型与自然耐受模型，两种模型的生存期、肝功能变化、移植物病理表现，符合急性排斥和自然耐受的特点，是进行肝移植免疫研究的良好的动物模式。
- 浦立勇姚爱华吕凌黄国荣李相成张峰王学浩
- 关键词：近交系同种异体排斥耐受
- 同时表达4-1BBL B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠肝癌细胞系的建立和意义被引量：3
- 2006年
- 目的:建立同时表达4-1BBL、B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)细胞系。方法:将B7.1和B7.2全长cDNA的质粒酶切,构建pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子,酶切法鉴定。用阳离子脂质体(LipofectamineReagent)将重组子转染H22,经均霉素(Hygromycin,300!g/ml)筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86+细胞。逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测目的基因在H22-CD80/CD86+变异株的表达。采用同样方法将pCI-neo-4-1BBL质粒转入H22-CD80/CD86+细胞,G418筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86/CD137L+细胞。流式细胞仪检测三种基因在细胞克隆中的表达。结果:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子经酶切鉴定,同时获得B7.1(862bp)和B7.2(984bp)目的基因片段和5.6kbp线性化pcDNA3.1载体片段;重组子测序结果与Genebank中B7.1和B7.2序列相符,证实构建成功。RT-PCR及FCM检测结果显示B7.1、B7.2及4-1BBL基因分别在H22-CD80/CD86+细胞及H22-CD80/CD86/CD137L+细胞中获得稳定、高效联合表达。结论:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子构建正确,H22-CD80/CD86/CD137L+变异株可同时稳定表达B7.1、B7.2和4-1BBL三个共刺激分子基因。
- 李国强王学浩印洁俞悦
- 关键词：B7.1B7.24-1BBL
- CD80 D86和CD17L基因联合表达增强细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性的机制被引量：2
- 2008年
- 目的探讨CD80、CD86和CD137L基因联合表达增强宿主细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性的机制。方法BALB／c小鼠随机分为5组，A组接种H22-Wt细胞，B组接种14_22．neo细胞，C组接种H22-CDS0／CD86细胞，D组接种H22-CD137L细胞，E组接种H22-CDS0／CD86／CD137L细胞。分别于第14、35、56和84天，每组每次随机选取2只小鼠处死取材。原位末端标记法（TUNEL）和DNA ladder法检测脾淋巴细胞凋亡。电泳迁移率法（EMSA）检测T细胞核因子KB（NF-KB）活性。结果TUNEL检测结果显示，接种后第14天，A、B组脾淋巴细胞即出现大量凋亡，D组凋亡虽然较A、B组明显减少，但仍远高于C、E组。随接种时间推移，C组脾淋巴细胞凋亡逐渐增多，而E组这一趋势不明显，至第84天，C组和E组的脾淋巴细胞凋亡指数分别为30．84-9．2和14．4±4．5。DNA ladder检测结果显示，接种后第14、35、56和84天，C组和E组均检测出典型阳性结果，其中以C组第35、56和84天凋亡最明显。EMSA检测结果显示，A、B组T细胞NF．KB活性很低，D组显著高于A、B组，C、E组则显著高于A、B和D组。随着接种时间推移，E组NF-KB活性一直维持较高水平，而C组呈现逐渐下降趋势，至第84天，C组和E组的T细胞NF-KB活性分别为14．01±1．04和41．16±5．78。结论1／22-CD80／CD86／CD137L^＋变异株接种荷瘤鼠后，CD28信号和CD137信号的协同作用可显著增强活化T细胞NF-KB活性，这可能是CD80、CD86和CD137L基因联合表达显著增强宿主CTL杀伤活性的机制之一。
- 印洁李国强俞悦施毅孙倍成成峰葛文刚王学浩
- 关键词：CD80CD86CD137L肝细胞癌核因子ΚB凋亡
- 超声和微泡超声造影剂介导核因子κB圈套寡核苷酸抗大鼠肝移植后的急性排斥被引量：2
- 2006年
- 目的:观察经超声介导的核转移因子κB圈套寡核苷酸作用后大鼠移植肝的肝功能变化、急性排斥的病理情况及受体的生存时间,探讨超声介导的核因子κB圈套寡核苷酸抗大鼠肝移植急性排斥的作用。方法:实验于2005-04/11在南京医科大学第一附属医院动物实验中心完成。①DA大鼠和Lewis大鼠各36只随机分为3组;每组DA大鼠(供体)、Lewis大鼠(受体)各12只,行DA大鼠至Lewis大鼠的原位肝移植。①对照组:对供肝无干预处理。②生理盐水组:生理盐水1mL+核因子κB圈套寡核苷酸100μg灌注供肝,并在冰水浴中经超声(频率2MHz)处理1min。③10%声诺维组:10%声诺维生理盐水1mL+核因子κB圈套寡核苷酸100μg灌注供肝,并在冰水浴中经超声(频率2MHz)处理1min。④检测各组受体大鼠(n=4)术后第1,4,7天的肝功能(天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶)变化、病理组织学检查术后第4天移植肝的排斥情况(n=4,按Banff标准进行程度分级,分为0,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,0级:无排斥证据;Ⅲ级:严重排斥)、统计各组受体大鼠生存率。结果:生理盐水组和10%声诺维组各有1只受体大鼠在术后3d内死亡,未纳入统计。进入结果分析34只。①肝移植术后各组受体大鼠天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶术后第1天便有不同程度的升高;10%声诺维组各时间点的天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶值明显低于对照组和生理盐水组(P<0.01);对照组和生理盐水组的转氨酶变化差异无显著性。②术后第4天病理组织学检查各组急性排斥情况:10%声诺维组急性排斥较对照组轻(P<0.05),与生理盐水组比较差异无显著性(P>0.05)。③10%声诺维组肝移植术后受体生存时间较对照组和生理盐水组明显延长(P<0.01);对照组与生理盐水组之间术后生存时间差异无显著性。结论:超声和微泡超声造影剂介导的核因子κB圈套寡核苷酸处理大鼠移植肝,能够改善术后移植�
- 徐三荣浦立勇李相成张峰王学浩
- 关键词：造影剂NFKB
- CD4^+CD25^+Tr细胞与大鼠肝移植自发免疫耐受关系的研究被引量：7
- 2006年
- 目的研究CD4+CD25+Tr细胞及其相关基因Foxp3与大鼠肝移植自发免疫耐受的关系。方法双袖套法建立大鼠原位肝移植模型;密度梯度离心法分离肝内淋巴细胞;免疫磁性分离法(MACS)分选CD4+CD25+T细胞,流式细胞术(FCM)检测所得细胞纯度。体外细胞增殖试验研究CD4+CD25+T细胞的免疫抑制作用。Western蛋白印迹法检测CD4+CD25+T细胞Scurfin蛋白表达。结果自发耐受组大鼠移植肝内CD4+CD25+Tr细胞含量显著高于急性排斥组。混合淋巴细胞反应中,LEW大鼠的脾细胞比DA大鼠自身的脾细胞更能刺激CD4+CD25+T细胞的增殖。CD4+CD25+T细胞能抑制CD4+CD25-T细胞的增殖,当加入外源性IL-2(200U/ml)时,该抑制作用被逆转。结论转录因子Foxp3介导的CD4+CD25+Tr细胞的免疫抑制作用可能是诱导大鼠肝脏移植自发免疫耐受的机制之一。
- 张峰吕凌浦立勇李相成姚爱华张伟俞悦王学浩
- 关键词：肝移植免疫耐受FOXP3基因
- 大鼠CD4^+CD25^+T调节细胞的分离培养及其功能分析被引量：5
- 2006年
- 目的:研究大鼠CD4+CD25+T调节细胞(Tr)的分离培养,并对其功能进行初步分析。方法:无菌条件下切取大鼠脾脏分离脾淋巴细胞。用免疫磁珠细胞分离系统(MACS)分选CD4+CD25+T细胞,并以流式细胞术检测其纯度后,对其进行扩增。采用混合淋巴细胞反应研究CD4+CD25+Tr细胞对CD4+CD25-T细胞的免疫抑制作用。用ELISA法检测培养上清中IL-2、IFN-γ及IL-10水平的差异。结果:MACS分离的CD4+CD25+T细胞的纯度达86%~93%。该细胞与CD4+CD25-T细胞相比能特异性地表达Foxp3基因。体外培养中能明显抑制效应T细胞增殖及其分泌IFN-γ、IL-2,但其自身能分泌Th2型细胞因子IL-10。结论:采用MACS系统阴性加阳性分选,可高效快速的获得理想纯度和免疫抑制功能的大鼠CD4+CD25+T调节细胞,该细胞对CD4+CD25-T细胞具有明显的免疫抑制作用,并能特异性的表达Foxp3基因。
- 吕凌张峰王学浩浦立勇姚爱华俞悦
- 关键词：CD4^+FOXP3免疫抑制
- 自发免疫耐受大鼠移植肝内调节性T细胞的生物学特性被引量：3
- 2007年
- 目的 研究大鼠肝移植后自发免疫耐受的形成与移植肝内CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Tr细胞）的关系。方法 按供、受者不同将实验分为3组。急性排斥组：DA大鼠为供者，LEW大鼠为受者；自发耐受组：LEW大鼠为供者，DA大鼠为受者；同基因组：供、受者均为DA大鼠。各组均建立大鼠原位肝移植模型。分别在肝移植术后4、7、14、30和90d时采用密度梯度离心法分离移植肝内淋巴细胞，免疫磁珠分离（MACS）法分选出CD4^＋CD25^＋Tr细胞；用流式细胞术（FCM）检测细胞纯度，同时分析CD4^＋CD25^＋Tr细胞比例的变化；体外细胞增殖试验研究CD4^＋CD25^＋Tr细胞对CD4^＋CD25^-T细胞的免疫抑制作用。结果 肝移植早期，急性排斥组和自发耐受组移植肝内CD4^＋CD25^＋Tr细胞比例均明显增加，其中急性排斥组增加更为明显；移植后4d左右，两组CD4^＋CD25^＋Tr细胞比例开始下降，急性排斥组的下降幅度较大；移植后30d，自发耐受组受者的移植肝内CD4^＋CD25^＋Tr细胞比例达到第2次高峰，约在移植后90d时下降至正常生理水平。移植后7d左右，急性排斥组受者均因发生排斥反应而死亡，而自发耐受组受者均存活。此外，CD4^＋CD25^＋Tr细胞能有效抑制CD4^＋CD25^-T细胞的增殖。结论 CD4^＋CD25^＋Tr细胞是一种具有特异免疫调节功能的T细胞亚群，其主动的免疫抑制功能可能是诱导大鼠肝移植自发免疫耐受的机制之一。
- 吕凌张峰浦立勇姚爱华俞悦孙倍成李国强王学浩
- 关键词：肝移植免疫耐受
- 4-1BBL基因真核表达载体构建及在肝癌细胞中表达的研究被引量：4
- 2003年
- 目的 研究含鼠源性 4 1BBL真核表达载体体系的构建及其在大鼠肝细胞癌 (HCC)细胞系CBRH7919中获得稳定、高效表达的方法。方法 将 4 1BBL全长cDNA亚克隆到真核表达载体PCI neo中 ,获得 4 1BBL定向插入重组子PCI neo 4 1BBL ,采用酶切法和测序法鉴定。用阳离子脂质体将PCI neo 4 1BBL转染CBRH7919,经G4 18筛选 ,获得阳性克隆 ,命名为PCI neo 4 1BBL CBRH7919+细胞。逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测 4 1BBL在CBRH7919中的表达。结果 PCI neo 4 1BBL经限制性内切酶切 ,电泳后显示有 980bp的 4 1BBL目的基因片段和 5 .4kb的线性化PCI neo载体片段 ;重组子测序结果与Genbank中 4 1BBLcDNA序列相符 ,证实构建成功。RT PCR检测到 4 1BBL在PCI neo 4 1BBL CBRH7919+细胞中获得稳定表达。结论 重组 4 1BBL真核表达载体构建正确 ,并在PCI neo 4 1BBL CBRH7919+细胞中获得稳定、高效表达。
- 李国强王学浩印洁俞悦
- 关键词：肝癌4-1BBL基因真核表达载体基因表达
- B7.1和B7.2基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究被引量：1
- 2004年
- 目的 构建含鼠源性B7 1和B7 2真核表达载体体系 ,研究其在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达的方法。方法 将目的基因全长cDNA分别亚克隆到真核表达载体PCI neo中 ,获得B7 1和B7 2正向单拷贝插入重组子PCI neo B7 1和PCI neo B7 2 ,采用酶切法和测序法鉴定。采用阳离子脂质体将PCI neo B7 1/B7 2分别转染CBRH7919,经G4 18筛选 ,获得阳性克隆 ,命名为PCI neo B7 1/B7 2 CBRH7919+细胞。逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测目的基因在CBRH7919中的表达。结果 PCI neo B7 1/B7 2酶切后 ,电泳显示 918bp和 94 2bp的目的基因片段和 5 4kbp的线性化PCI neo载体片段 ;重组子测序结果与Genebank中B7 1和B7 2序列相符 ,证实构建成功。RT PCR检测结果显示B7 1和B7 2均在PCI neo B7 1/B7 2 CBRH7919+中获得稳定表达。结论 重组真核表达载体构建正确 ,并在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达 ,为其在肝癌分子免疫治疗研究中应用奠定基础。
- 李国强王学浩印洁俞悦
- 关键词：B7.1B7.2基因真核表达载体肝癌
- DA到Lewis大鼠肝脏移植急性排斥模型的建立被引量：9
- 2006年
- 目的：建立大鼠原位肝脏移植的急性排斥模型并观察其排斥反应的特点．方法：采用近交系雄性DA大鼠为供体，Lewis大鼠为受体，改良“二袖套”法建立肝脏移植模型30例．随机分为两组，对照组（n=15）术后不用免疫抑制剂，FK506处理组（n=15）术后1-7d用FK506 0．2mg／（kg·d）灌胃．术后4，7和10d分别随机处死3只，检测血清肝功能生化指标[天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（BILI）]以及肝脏病理组织学变化，每组各留6只观察生存期．结果：术后7和10d时对照组血清AST，BILI浓度均高于FK506处理组[AST：7d，（17．74±3．6）μkat/L vs（7．94±1．6）μkat/L，P〈0．05；10d，（21．94±4．3）μkat/L vs（4．74±0．7）μkat/L，P〈0．05．BILI：7d，（90．94±18．8）μmol／L vs（6．84±0．7）μmol／L，P〈0．05；10d，（111．54±23．3）μmol／L vs（15．54±3．2）μmol／L，P〈0．05]．术后7d，对照组移植物出现明显的排斥反应的病理学变化，10d时更为严重．FK506组术后7和10d病理学检查为不明确或轻度的排斥表现．对照组中位生存时间为12d，95％可信区间为（11．77-13．90）d（n=6，12d×4，14d×1，15d×1）．FK506处理组中位生存时间为78d，95％可信区间为（65．26-90．74）d（n=6，〉65 d×1，〉67d×1，76 d，78d，89d和90d），生存时间明显较对照组延长（P〈0．05）．结论：DA到Lewis大鼠品系组合可以建立稳定可靠的肝脏移植急性排斥模型；该模型的排斥反应的特点与临床相似，且可以为抗排斥药物FK506预防而达到长期存活．
- 浦立勇姚爱华李相成陆森成峰张峰王学浩
- 关键词：排斥反应近交系
