利用 PCR和点突变 PCR技术 ,制备了大肠杆菌不耐热肠毒素 (L T)突变体 L TR72和 L T的基因片段 ,经酶切连接后构建了突变体重组质粒 p L TR72 ,经酶切和序列测定证明重组子构建正确 ,目的突变点第 72位的丙氨酸密码子已被突变成为精氨酸密码子。同时 ,试验构建了可以表达天然 L T的表达质粒 p L T作对照。二级结构分析表明 ,L TR72及 L
将重组质粒 p L TR72和 p L T分别转化大肠杆菌 JM10 1、DH5 α 和 C6 0 0 ,并接种于 L B和 CAYE- 2中培养 ,用GM1- EL ISA法检测菌体裂解液中 2者的表达情况 ,将表达产物纯化后用 SDS- PAGE等方法鉴定。结果表明 ,3种大肠杆菌在 2种培养基中都可表达出 L T突变体和 L T,并可将产物分泌到大肠杆菌胞周质中 ,成为具有 GM1结合活性的突变体蛋白 ;鉴定纯化后的突变体的组成形式与野生型 L T相同 ,均是 1A∶ 5 B。
