国家自然科学基金(30300305)
- 作品数：5 被引量：13H指数：2
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- 相关机构：西安交通大学医学院第二附属医院西安交通大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家教育部博士点基金更多>>
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- 蛋白表达的亚细胞定位影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平的研究
- 2012年
- 目的研究表达产物的不同亚细胞定位对基因免疫诱导的体液免疫应答水平的影响,为基因疫苗的设计提供参考。方法利用分子克隆技术,分别构建能表达不同细胞定位的EGFP-HPVl6L1融合蛋白和截短型EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白的重组pcDNA-EGFP-HPV16L1和pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS真核表达载体;通过转染CHO细胞,并在倒置荧光显微镜下观察表达产物的细胞定位;用重组pcDNA载体免疫BALB/c小鼠;EGFP作为抗原,ELISA法检测血清抗体吸光度。结果①重组pcDNA-EGFP-HPV16L1转染的CHO细胞核内可见到绿色荧光,pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体转染的CHO细胞质内可见到绿色荧光:②两种不同的重组pcDNA载体均可诱导BALB/c小鼠体液免疫反应,但重组pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体免疫组小鼠IgG抗体A_(450)值显著高于重组pcDNAEGFP-HPV16L1真核表达载体免疫组小鼠IgG抗体A_(450)值(P<0.001)。结论表达产物的不同细胞定位可影响基因免疫诱发的体液免疫应答水平,定位于细胞质内的蛋白分子较定位于细胞核的蛋白分子能诱导机体更强的体液免疫反应,这为以增强体液免疫反应为目的的基因疫苗的设计提供了参考。
- 杨军陈晓黎王一理司履生
- 关键词：抗体生成核定位信号基因免疫
- 抗HPV16L1IgY抗体的制备及活性检测被引量：9
- 2008年
- 目的制备出高特异性的抗HPV16L1IgY抗体,为HPV16L1蛋白的检测提供一种方法。方法用纯化HPV16L1蛋白免疫母鸡,分别收集鸡蛋,4℃下保存备用;经聚乙二醇法提取鸡蛋黄中IgY抗体;用酶联免疫吸附法检测IgY抗体效价的测定;采用免疫组织化学法通过对转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中L1蛋白的检测评价IgY抗体的特异性。结果3次免疫之后,IgY抗体效价达到1:10240,同时可特异性与转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中EGFP-HPV16L1结合。结论采用HPV16L1蛋白免疫母鸡,成功获得了较高效价的特异性IgY抗体,并可用于HPV16L1蛋白的细胞学检测,为IgY抗体在免疫组织化学检中的应用提供实验依据。
- 杨军张明娟强磊苏宝山王一理司履生
- 关键词：鸡蛋黄IGY
- 抗HPV16L1 IgY抗体的制备
- 目的本研究目的在于制备出高特异性的抗HPV16L1 IgY抗体,为HVPL1蛋白的检测提供一种方法,同时探讨IgY抗体在免疫组织化学中的应用。方法用纯化HPV1611蛋白免疫母鸡,分别收集鸡蛋,4℃下保存备用;经聚乙二醇...
- 杨军强磊赵世平苏宝山陈晓黎王一理司履生
- 关键词：鸡蛋黄IGY
- 文献传递
- HPV16L1核浆运输的动力学过程被引量：2
- 2006年
- 利用增强型绿色荧光蛋白(Enhancegreenflurenscentprotein,EGFP)标记不同的截短型HPV16L1蛋白(Humanpapillomavirustype16L1protein,HPV16L1),分析HPV16L1蛋白核定位信号(Nucleuslocationsignal,NLS)的作用。构建重组pFB-EGFP、pFB-EGFP-HPV16L1、pFB-EGFP-HPV16L1△NLS和pFB-EGFP-NLSHPV16L1p转移载体;在DH10Bac宿主菌内经Tn7转座子介导的同源重组后转染Sf-9细胞,获得重组Ac-EGFP、Ac-EGFP-HPV16L1、Ac-EGFP-HPV16L1△NLS和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒,感染Sf-9昆虫细胞表达相应截短型HPV16L1融合蛋白;利用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察不同融合蛋白的荧光特性和核浆转运动力学过程。结果发现Ac-EGFP杆状病毒感染的Sf-9细胞内明亮的绿色荧光均匀分布;重组Ac-EGFP-HPV16L1和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒感染的Sf-9细胞,明亮的绿色荧光主要位于细胞核内;重组Ac-EGFP-HPV16L1△NLS杆状病毒感染的Sf-9细胞,绿色荧光局限于细胞浆内,细胞核内无绿色荧光。说明HPV16L1蛋白羧基端的23个氨基酸(GKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL)具有完全核定位作用,能引导HPV16L1蛋白和EGFP突破核膜屏障进入Sf-9细胞核内。
- 杨军王一理司履生
- 关键词：人乳头瘤病毒16型核定位信号增强型绿色荧光蛋白
- HPV16L1△NLS影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平
- 基因免疫不仅能诱导细胞免疫应答的发生还诱导机体产生一定程度的体液免疫反应,为包括病毒性疾病在内的传染病的免疫预防以及肿瘤的免疫治疗提供了一条新的途径,然而,在某些病毒性感染的免疫预防中能否诱导机体高水平的体液免疫应答、产...
- 杨军陈晓黎王一理司履生
- 关键词：体液免疫核定位信号
- 文献传递
- 采用杆状病毒表达系统表达EGFP标记的HPV-16L1病毒样颗粒
- 2007年
- 目的制备增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的人乳头状瘤病毒16型（HPV-16）病毒样颗粒，为研究HPV-16L1的生物学活性提供一种方法。方法采用Xbal＋HindⅢ双酶切pGEM-T-HPV-16质粒，获得HPV-16L1基因片段，用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因片段，NcoⅠ＋SalⅠ双酶切，依次克隆入杆状病毒转移载体，获得重组pFB-EGFP-HPV-16L1转移载体；在DHIOBac内通过转座子Tn7的介导，获得重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒；感染Sf-9昆虫细胞；荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法确定融合蛋白的荧光特性及细胞学定位；利用Western blot分析融合蛋白的表达；电子显微镜观察病毒样颗粒（VLP）的形成；利用小鼠红细胞凝集试验及凝集抑制试验分析生物学活性。结果重组pFB-EGFP-HPV-16L1辅助表达载体及重组杆状病毒中EGFP-HPV-16L1融合基因构建正确；荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒AC-EGFP-HPV-16L1的Sf-9细胞核内可见耀眼的绿色荧光，免疫组织化学证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白主要位于Sf-9细胞核内；Western blot证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白相对分子质量（Mr）为83×10^3，与理论值一致；透射电子显微镜观察发现感染重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒的Sf-9细胞核内和裂解上清内均可发现大量形态均一的vIJP形成；小鼠红细胞凝集试验证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白可引起小鼠红细胞凝集，且可被抗HPV-16L1单克隆抗体抑制。结论杆状病毒表达系统表达的EGFP标记的HPV-16L1蛋白既能自组装成病毒样颗粒、具有构象依赖性生物学活性，又能发射易于检测的绿色荧光，有可能用于HPV-16L1蛋白的生物行为研究，并实时可视化追踪其在宿主细胞内的转运过程。
- 杨军王一理司履生
- 关键词：人乳头状瘤病毒16型重组杆状病毒增强型绿色荧光蛋白病毒样颗粒
- 新型EGFP标记的杆状病毒转移载体的构建及EGFP的制备被引量：2
- 2006年
- 目的构建可表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体,利用Sf-9细胞表达、制备EGFP。方法用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因,NcoⅠ/SalⅠ双酶切,克隆入杆状病毒转移载体NcoⅠ/SalⅠ酶切位点之间,获得pFB-EGFP质粒;转化E.coliDH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Ac-EGFP;感染Sf-9昆虫细胞;利用激光共聚焦显微镜和SDS-PAGE观察并检测EGFP的表达。非变性法纯化EGFP。结果荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染的Sf-9细胞可表达EGFP;通过SDS-PAGE获得的EGFP,大小为27ku。结论重组pFB-EGFP载体具备表达EGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达EGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。
- 杨军王一理司履生
- 关键词：昆虫杆状病毒表达系统增强型绿色荧光蛋白
