国家自然科学基金(30440011)
- 作品数：4 被引量：27H指数：3
- 相关作者：李永清章振华张莉罗长保周雪媚更多>>
- 相关机构：北京市农林科学院畜牧兽医研究所广州出入境检验检疫局军事医学科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建被引量：5
- 2007年
- 将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDVCVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、dot blotting,Western blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1(CVI988)基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIVA/Chicken/Guangdong/00(H9N2)攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。
- 李永清杨敬罗长保周雪媚张莉章振华
- 关键词：禽流感病毒马立克氏病病毒
- 鸡补体因子C3d增强禽流感病毒M2蛋白体液免疫应答
- 引言及目的：在动物的免疫系统中,补体因子 C3d 作为分子佐剂在先天性免疫和获得性之间发挥桥梁作用,C3d 能作为一种分子免疫佐剂连接在不同抗原上,有效提高体内针对该抗原的特异性抗体的滴度和抗体持续时间 M2蛋
- 李永清章振华张莉陈福勇姜北宇王金洛
- 文献传递
- 抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定被引量：8
- 2008年
- 目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2和GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株。mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测mAb的特性。结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3和5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1∶4。抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2F8和5G6为IgG2b。抗原捕获ELISA表明,2F8 mAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应。IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合。结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8 mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂。
- 李永清杨敬张莉韦莉
- 关键词：禽流感病毒单克隆抗体
- 鸡补体分子C3d的基因克隆及结构分析被引量：12
- 2006年
- 目的:克隆鸡补体分子C3d基因并解析其结构特点。方法:将已发表的人、小鼠、地鼠、奶牛、野兔、猪、猩猩、绵羊的C3d基因同鸡的C3α链进行序列比较分析,发现在鸡的C3α链上有一段约897bp的序列同上述动物有较高的同源性,在上下端保守区域设计一对引物788bp,应用RT-PCR扩增鸡C3d部分基因,并克隆到pMD18-T载体中,测序正确后再在上下端分别设计一对引物,理论长度分别为378和336bp,最后用3种PCR产物延伸扩出C3d全长序列。结果:获得了鸡C3d基因重组质粒pMD18-C3d,序列分析表明所获的鸡C3dcDNA全长为993bp,编码331个氨基酸残基。鸡与上述人或动物C3d核苷酸的同源性分别为66.6%、66.2%、67.7%、66.2%、67.1%、67.0%、59.6%、67.1%,与其编码的氨基酸的同源性分别为61.5%、61.9%、61.2%、61.9%、56.5%、61.9%、54.5%、61.5%;而哺乳动物间C3d的核苷酸和氨基酸的同源性则分别为74.2%～100%和72.2%～100%。进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。结论:鸡C3d与其他动物的C3d在抗原结合位点上没有氨基酸的变化,而与CR2结合的28肽区氨基酸差异明显,说明鸡C3d结合抗原没有专一性,而结合免疫细胞则有种的特异性,由此可以推测鸡C3d只能增强鸡的特异性免疫反应。
- 章振华周雪媚谌南辉陈小玲罗长保李永清
- 关键词：基因克隆
- 鸡补体因子C3d对禽流感病毒M2蛋白免疫应答反应的增强作用被引量：2
- 2007年
- M2蛋白是禽流感病毒中具有交叉保护性的结构蛋白,但其抗原性差,难以诱导高水平的免疫反应.分别将一个鸡补体因子C3d,2个C3d基因同禽流感sM2基因(缺失跨膜区的M2基因)以柔性肽链Linker串联连接,构建了4个重组质粒并在大肠杆菌中表达出4种带有谷胱苷肽硫转移酶(GST)的融合蛋白:GST-C3d-sM2,GST-C3d-L2-sM2,GST-C3d-L1-C3d-sM2,GST-C3d-L1-C3d-L2-sM2.将纯化后的4个融合蛋白及对照GST-sM2蛋白免疫BALB/c鼠4次(每组10只),结果在三免后,4个融合蛋白免疫的BALB/c鼠体内抗sM2抗体滴度与对照组相比均差异显著(p<0.05),并且GST-C3d-L1-C3d-L2-sM2组的抗体滴度最高.另外,分别构建重组质粒pcDNA-sM2和pcDNA-C3d-L1-C3d-L2-sM2,然后以这两种DNA疫苗与蛋白GST-C3d-L1-C3d-L2-sM2和GST-sM2同时接种14日龄SPF鸡3次(每组15只).结果表明,蛋白GST-C3d-L1-C3d-L2-sM2和对照组GST-sM2的抗sM2抗体滴度差异明显(p<0.01),而pcDNA-C3d-L1-C3d-L2-sM2平均sM2抗体滴度也明显高于对照组pcDNA-sM2(p<0.05).分别以脂多糖(LPS)和刀豆蛋白(ConA)作为致裂原对SPF鸡的外周血淋巴细胞进行淋巴细胞转化试验(MTT法).结果以LPS刺激的淋巴细胞的增殖程度在融合蛋白GST-C3d1-L1-C3d2-L2-sM2免疫组与对照组GST-sM2之间以及pcDNA-C3d-L1-C3d-L2-sM2免疫组与对照组pcDNA-sM2之间均差异极显著(p<0.01),而ConA刺激的淋巴细胞各组之间则无显著差异.所有这些结果证实,鸡补体因子C3d无论是在原核系统表达的融合蛋白,还是插入DNA疫苗中均可以增强禽流感病毒M2蛋白引起的免疫应答反应.
- 章振华李永清张莉陈福勇姜北宇陈小玲
- 关键词：免疫应答反应分子佐剂
