天津市自然科学基金(10JCYBJC10600)
- 作品数：5 被引量：2H指数：1
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- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院北京协和医学院天津华立达生物工程有限公司更多>>
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- 人脐带内皮祖细胞的分离、鉴定及转染EGFP质粒的实验研究
- 2012年
- 目的从脐带中分离内皮祖细胞（EPCs），考察其体外增殖、基因转染绿色荧光蛋白质粒的行为。方法以酶消化法从脐带中分离出内皮祖细胞，并通过流式细胞仪和共聚焦显微镜对内皮祖细胞进行鉴定，以Lipofectamine2000为转染试剂考察了内皮祖细胞转染绿色荧光蛋白质粒的行为。结果从脐带中分离培养的内皮祖细胞在第9天形成了典型的内皮细胞集落，流式细胞仪分析结果显示CD133和激酶插入区受体（KDR）的含量均有所提高，并具有内皮祖细胞结合异硫氰酸荧光素（FITC）标记的荆豆凝聚素1（FITC—UEA-1）和吞噬DiI标记的低密度脂蛋白（DiI—ac—LDL）的功能，能较好地表达绿色荧光蛋白。结论从脐带中分离的内皮祖细胞体外在适当的培养条件下，可增殖、诱导分化为内皮细胞，并能较好地表达外源基因，是基因与细胞治疗理想的载体。
- 朱敦皖宋丽萍刘兰霞董霞张海玲王海冷希岗
- 关键词：内皮祖细胞脐带基因转染
- RGD多肽化学修饰聚苯乙烯培养板的细胞相容性研究
- 2012年
- 目的考察RGD多肽化学修饰聚苯乙烯培养板细胞相容性研究。方法采用高锰酸钾硫酸溶液对聚苯乙烯表面进行氧化反应，生成羧基位点；水溶性碳二亚胺活化羧基，接枝明胶、胶原和RGD多肽。用红外光谱、X-射线光电子能谱（XPS）、动态接触角等研究了RGD化学修饰聚苯乙烯的变化，并考察了RGD化学修饰聚苯乙烯后细胞相容性的变化。结果XPS结果证实了聚苯乙烯表面N原子的引入，RGD是共价键合在聚苯乙烯表面的。动态接触角下降显著，证明修饰表面的亲水性能提高。在修饰后的聚苯乙烯培养板种植人表皮细胞，结果显示提高了细胞的黏附和增殖能力。结论聚苯乙烯表面进行RGD化学修饰，有利于提高细胞在其表面的黏附和增殖能力，有望为免疫磁珠分离得到的高纯度内皮祖细胞提供良好的培养介质。
- 王海梁士民刘兰霞庞丽云张超葛泉波朱敦皖
- 关键词：RGD多肽聚苯乙烯细胞相容性内皮祖细胞
- 组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达
- 2011年
- 目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。
- 宋丽萍楼莎朱敦皖刘兰霞张海玲董霞董庭婷冷希岗
- 关键词：组织因子途径抑制因子绿色荧光蛋白血管再狭窄
- N-亚甲基磷酸化壳聚糖基因纳米粒子的体外细胞毒性及基因转染实验研究被引量：1
- 2012年
- 目的 考察N-亚甲基磷酸化壳聚糖（ NMPCS）基因纳米粒子的体外细胞毒性及基因转染效率.方法 采用均相反应法制备了NMPCS,用复凝聚法制备了NMPCS/DNA纳米粒子；通过MTT实验考察了NMPCS及其与DNA复合物对HeLa细胞的细胞毒性,以荧光索酶质粒为报告基因考察了NMPCS及NMPCS-CaZ＋载体介导的体外基因转染效率.结果 NMPCS及其与DNA的复合物在体外表现出很小的细胞毒性,远远低于同等浓度时聚乙烯亚胺（PEI）的毒性.通过对壳聚糖进行亚甲基磷酸化修饰后,可大幅提高载体的基因转染效率.结论 N-亚甲基磷酸化壳聚糖有望成为一种新型、安全、高效的非病毒基因载体.
- 宋丽萍朱敦皖刘兰霞董霞王海柏金根冷希岗
- 关键词：非病毒载体基因转染
- 双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达被引量：1
- 2010年
- 目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）与绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞（EPCs）中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.
- 王海燕宋丽萍朱敦皖周波刘珍宝楼莎冷希岗
- 关键词：内皮祖细胞逆转录病毒载体组织因子途径抑制因子
