国家自然科学基金(30872721)
- 作品数：6 被引量：2H指数：1
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- 相关机构：吉林大学第一医院吉林大学白求恩第一医院上海交通大学医学院附属瑞金医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 可分泌表达Aβ阻断肽融合基因原核表达载体的构建
- 2010年
- 目的构建神经营养素3(NT3)信号肽、Aβ1-42阻断肽ABAD-DP、溶源肽HA2及穿膜肽TAT融合基因的原核表达载体pBV220/NAHT,为将Aβ1-42阻断肽ABAD-DP用于AD基因治疗提供实验基础。方法采用非对称互补引物/模板法,分别制备两端含有酶切位点的ABAD-DP和HA2-TAT的cDNA,将其连接到NT3的信号肽3′端,组成融合基因NT3-ABAD-DP-HA2-TAT(NAHT),再将该融合基因亚克隆于原核表达载体pBV220,构建原核表达载体pBV220/NAHT。结果经DNA测序证实成功克隆ABAD-DP和HA2-TATcDNA;经限制性内切酶酶切证实成功将ABAD-DP和HA2-TAT基因重组到NT3信号肽的3′端,并将融合基因亚克隆于pBV220载体内。结论成功构建了表达NT3信号肽、阻断肽ABAD-DP、融源肽HA2及穿膜肽TAT融合基因的原核表达载体pBV220/NAHT。
- 杨宇杨欣孙欣吴昊吴江
- 关键词：神经营养素3基因治疗原核表达载体
- 适配子技术在中枢神经系统疾病中的研究进展
- 2011年
- 适配子（aptamer）是能够与靶分子以高亲和力、高特异性结合的相对短小的核酸或肽,大部分适配子通过＂指数富集的配体系统进化＂（SELEX）技术筛选而来。
- 王旭杨宇吴江
- 关键词：中枢神经系统疾病适配子特异性结合高亲和力靶分子
- 可分泌表达神经保护肽的重组慢病毒对闭合性脑损伤小鼠的神经保护作用
- 2010年
- 目的:通过滴鼻给药途径,给予闭合性脑损伤小鼠可分泌表达神经保护肽NAP的重组慢病毒,观察该重组病毒经鼻-脑通路对中枢神经系统的保护作用,为携带可分泌表达NAP的重组慢病毒治疗神经系统退行性疾病提供理论依据。方法:选用8～12周成年雄性昆明小鼠54只,随机分为4组:空白对照组10只(Control组)、重锤加害组20只(CHI组)、重组慢病毒rLent/NT4-NAP保护组20只(rLent组)和重组慢病毒rLent/GFP组4只(GFP组)。观察各组小鼠的死亡率、神经功能损伤(NSS)评分、脑水肿含量和病理改变情况。应用共聚焦显微镜观测GFP组小鼠鼻黏膜、嗅神经和脑组织内绿色荧光表达情况。结果:rLent组小鼠死亡率(15%)明显低于CHI组小鼠(55%);rLent组小鼠NSS评分在创伤后1、3、5和7d均显著低于CHI组(P<0.01);rLent组小鼠创伤后24h的脑水肿含量明显低于CHI组(P<0.01);HE染色显示rLent组小鼠病理改变明显轻于CHI组;GFP组仅在鼻黏膜处可见呈条索样的绿色荧光,而在嗅神经及大脑则未发现绿色荧光。结论:分泌表达NAP的重组慢病毒可感染鼻黏膜细胞,分泌表达的短肽NAP能够改善闭合性脑损伤小鼠的神经功能;未加装分泌表达元件的重组病毒rLent/GFP仅能感染鼻黏膜细胞,不能通过血脑屏障进入中枢神经系统。
- 杨宇杨欣孙欣吴昊王全颖杨广笑吴江
- 关键词：慢病毒闭合性脑损伤
- 抗Aβ42细胞内抗体TAT-6His-mAbA/B的构建
- 2011年
- 目的构建能够在细胞内特异性拮抗Aβ42的小分子细胞内抗体TAT-6His-mAbA/B,为细胞内抗体技术用于AD的诊断和治疗提供新依据。方法根据GenBank提供的Aβ42单克隆抗体的已知序列,选取重链和轻链可变区(CDR1和CDR3)进行偶联,应用DNASIS计算机软件设计引物,通过两次PCR获得目的片段mAbA/B。将目的片段与pGEM-Teasy载体相连,限制性内切酶酶切鉴定重组质粒,Sanger单链末端终止法测出克隆的核苷酸序列。结果限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-TEasy/mAbA/B,可见132bp或141bp的目的片段,与理论值一致;DNASIS软件分析测序结果与GenBank所报道的结果完全一致。限制性内切酶PamHI和BamH I联合酶切pssHG-CMV/TAT-6His-mAbA/B,琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒,得到大小约为400bp的融合基因TAT-6His-mAbA/B目的片段,与理论值一致。结论通过PCR方法成功克隆了Aβ42小分子细胞内抗体TAT-6His-mAbA/B片段。
- 车丽赫吴江杨弋李超王明宇王旭杨广笑王全颖孙欣杨宇
- 关键词：阿尔茨海默病细胞内抗体SCFVAΒ
- Aβ阻断肽适配子TRX1-ABAD-DP-TRX2融合基因的克隆及表达被引量：2
- 2012年
- 目的 将Aβ阻断肽（ABAD-DP） cDNA插入人硫氧化还原蛋白（hTRX）的活化位点,克隆融合基因TRX1-ABAD-DP-TRX2 （T-A-T） cDNA,为基因治疗阿尔茨海默病奠定基础.方法 通过PCR获得目的片段TRX1、TRX2、ABAD-DP,进一步将上述3目的片段按既定顺序插入腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV的多克隆位点,从而获得融合基因TRX1 -ABAD-DP-TRX2.经PEI介导Hela细胞包装重组腺相关病毒rAAV/T-A-T.感染NIH-3T3细胞,通过荧光免疫组织化学染色检测融合基因的表达及其与Aβ42的定位.结果 酶切后得到TRX1 -ABAD-DP-TRX2融合基因片段的大小约为435 bp,与理论值一致.荧光免疫组织化学染色检测到融合基因的表达,且共定位组T-A-T和Aβ42均位于NIH-3T3细胞胞质内.结论 成功克隆及表达了Aβ阻断肽适配子TRX1-ABAD-DP-TRX2融合基因,为进一步将阻断肽用于基因治疗阿尔茨海默病提供了基础.
- 王旭吴江杨弋王明宇车丽赫杨宇
- 关键词：融合基因
- 鼻粘膜内分泌表达大分子蛋白沿“鼻-脑”通路入脑的研究
- 2010年
- 目的利用分子生物学技术寻求将大分子蛋白类药物沿"鼻-脑"通路长期稳定导入脑内的方法。方法昆明小鼠8只,随机分为两组,每组4只。分别滴鼻给予小鼠已构建成功的PSSHG/NT4-GFP-Ant穿膜肽重组腺相关病毒和对照组PSSHG/GFP重组腺相关病毒,每次每只鼻孔滴入10μl病毒液,每日1次,连续滴鼻5d。10d后处死小鼠,脑组织冰冻切片,共聚焦显微镜观测脑组织内绿色荧光表达情况。结果滴鼻PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒小鼠组可在鼻粘膜、嗅球、海马观测到绿色荧光表达,其余脑组织内未见荧光表达。而对照组PSSHG/GFP重组腺相关病毒小鼠组鼻粘膜上可见绿色荧光表达,嗅球、海马、其他脑组织未见荧光表达。结论两种重组腺相关病毒均能感染鼻粘膜细胞,并在鼻粘膜处表达目的蛋白;用腺相关病毒介导体内分泌表达的单纯大分子蛋白不能沿鼻-脑途径入脑;用腺相关病毒介导体内分泌表达经穿膜肽修饰的大分子的报告蛋白可沿鼻-脑途径入脑。
- 吴昊吴江孙珉丹孙欣杨宇
- 关键词：冰冻切片共聚焦显微镜
