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表达可溶性TβRⅡ胞外区腺病毒载体的构建及功能试验研究: 2006年; 目的:探讨表达可溶性TβRⅡ胞外区片段的腺病毒载体构建,及其在肿瘤生物治疗学方面的作用机制和效果。方法:RT-PCR法克隆鼠源性TβRⅡ胞外区编码序列,采用AD-easyXLAdenovirusVectorSystem试剂盒构建表达上述基因的腺病毒载体。通过ELISA试验验证表达可溶性TβRⅡ胞外区序列的腺病毒载体转染细胞后所具有的阻断TGF-β的作用。应用于小鼠体内试验,观察该病毒载体对免疫效应细胞抗肿瘤活性的影响,从而评价其在肿瘤治疗方面的作用。结果:克隆了鼠源性TβRⅡ胞外区编码序列并成功地构建了表达这些基因的腺病毒载体。功能试验表明由腺病毒表达的TβRⅡ胞外区片段具有阻断TGF-β信号通路的作用。体内试验则表明应用于荷瘤小鼠可抑制肿瘤的发展。结论:表达可溶性TβRⅡ胞外区片段的腺病毒载体可显著地提高免疫细胞的杀伤能力,抑制肿瘤生长,为肿瘤的生物学治疗提供了新的研究方向。; 史业辉李慧曹水陈鹏刘虹魏枫王旭东任秀宝; 关键词：腺病毒生物治疗

人和鼠源性RANTES基因的克隆和腺病毒表达载体的建立被引量：4: 2004年; 目的 :克隆人和小鼠的活化T细胞表达与分泌调节基因 (RANTES基因 )并分别构建腺病毒表达载体。方法 :利用RT -PCR方法从人的扁桃体组织和小鼠的脾细胞中克隆RANTES基因并将其克隆入T -easy保存载体中 ,使用Stratagene公司的ADEasy -XL腺病毒载体组装试剂盒建立表达该基因的腺病毒表达载体并使用CsCl2 密度梯度离心法浓缩病毒悬液。空斑试验显示病毒的滴度为2×1011cfu/ml。结果 :该实验成功地克隆了人和小鼠的RANTES基因并分别建立了表达该基因的腺病毒表达载体。结论; 史业辉曹水刘虹李慧任秀宝

表达转化生长因子βⅡ型受体胞外区-活化T细胞表达和分泌的调节因子融合基因重组腺病毒的构建与鉴定被引量：1: 2007年; 目的构建表达转化生长因子βⅡ型受体(TβRⅡ)胞外区-活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)融合基因重组腺病毒并鉴定其在肿瘤细胞的表达。方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增小鼠TβRⅡ胞外区和RANTES基因,重叠PCR法扩增TBRⅡ胞外区-RANTES融合基因,将融合基因克隆至pDC316载体,采用AdMax Adenovirus Vector Creation试剂盒构建融合基因重组腺病毒载体,融合基因重组腺病毒按moi=100:1的比例体外感染小鼠肺腺癌L795细胞系,Western Blot方法检测感染后肿瘤细胞的蛋白表达。结果RT-PCR正确扩增了440 bp TβRⅡ胞外区、244 bp RANTES基因,重叠PCR正确扩增了745 bp TpRⅡ胞外N-RANTES融-合基因,重组质粒融合基因-pDC316经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×10^(10)pfu/ml,感染后的LA795细胞有相对分子质量为33000的蛋白表达。结论成功构建表达TBRⅡ胞外区-RANTES融合基因重组腺病毒载体,为进行体内抗肿瘤基因治疗的研究创造条件。; 王旭东刘虹曹水李慧任秀宝郝希山; 关键词：转化生长因子-Β 融合基因重组腺病毒

表达RANTES基因的腺病毒载体构建及抗肿瘤作用研究被引量：2: 2006年; 目的:构建表达活化T细胞表达和分泌的调节因子(regulatedonactivationnormalTexpressedandsecreted,RANTES)基因的腺病毒载体并研究其抗肿瘤作用机制和效果。方法:RT-PCR法克隆人和鼠源性(regulatedonacti-vationnormalTexpressedandsecreted,RAN-TES)基因,采用AD-easyXLAdenovirusVectorSystem试剂盒分别构建表达上述基因的腺病毒载体。通过趋化试验验证表达RANTES基因的腺病毒载体转染细胞后所具有的趋化肿瘤免疫细胞的作用。应用于体外及小鼠体内试验,包括成瘤试验及抑瘤试验,通过观察免疫效应细胞对小鼠体内肿瘤的抑制作用来评价其在肿瘤治疗方面的作用。结果:克隆了人和鼠源性RANTES基因编码序列并成功地构建腺病毒表达载体;功能试验表明由腺病毒表达的RANTES具有趋化肿瘤免疫细胞的作用。体内试验表明该病毒载体可抑制肿瘤细胞成瘤作用,应用于荷瘤小鼠可抑制肿瘤的发展,延长荷瘤小鼠的生存时间。结论:表达RANTES基因的腺病毒载体可显著地趋化免疫细胞到肿瘤局部杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞成瘤作用并延长荷瘤小鼠的生存时间,为肿瘤的生物学治疗提供了新的研究方向。; 史业辉李慧曹水刘虹魏枫王旭东任秀宝; 关键词：RANTES 腺病毒科生物疗法

TβR-Ⅱ-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用被引量：3: 2007年; 目的构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)重组腺病毒载体,并观察其抗肿瘤作用。方法RT-PCR扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。采用adMax adenovjrus vector creation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒。体外感染小鼠肺腺痛LA795细胞系,绘制细胞生长曲线。采用Western blot法检测感染后细胞融合基因的表达;酶联免疫吸附试验(FLISA)法检测其培养上清的蛋白含量;Annexin V-FITC法检测感染后细胞的凋亡;并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用。将感染后的细胞(1×105个)接种于T739小鼠,观察成瘤时间和生存时间;1×1010pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠,观察肿瘤的大小变化,并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率。结果经测序证实,RT-PCR正确扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTFS基因,重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×1010pfu/ml。Western blot结果表明,感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现;培养上清中,游离TGF-β1的水平显菩减低,而RANTES的水平显著升高。感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低,凋亡率为16.9%;培养上清可趋化小鼠脾细胞,与对照组之间差异均有统计学意义。感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比,体内成瘤时间和生存时间明显延长;局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率为37.6%。结论成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF-β1,显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态,高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能,具有显著的抗肿瘤作用。; 王旭东刘虹曹水李慧任秀宝郝希山; 关键词：RANTES 融合基因重组腺病毒载体

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国家自然科学基金(30300438)

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