重庆市自然科学基金(CSTC2011BA5039)
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- 二甲基酚橙法测定尿酸酶活性和识别尿酸酶高活性突变体
- 2013年
- 考察了采用二甲基酚橙测定过氧化氢(Xylenol-orange-assay-of-hydrogen-peroxide,XOAHP)法测定尿酸酶活性的可靠性以及识别高活性尿酸酶突变体的方法.将苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidious)尿酸酶4种突变体成对组合,使其催化效力比值在1.3-4.1间变化;将每种突变体表达载体转化大肠杆菌,取30个克隆分别转移到1.0 mL液体培养基放大,18℃诱导表达16 h,收集细胞后超声裂解得裂解液.在pH 8.9的Tris-HCl缓冲液中0.33 mmol/L以下尿酸对XOAHP法测定尿酸酶活性无干扰.SDS-PAGE分析发现不同突变体蛋白表达丰度有差异,酶活性同裂解液中总蛋白浓度正相关.Receiver-operation-curve(ROC)分析发现尿酸酶间催化效力比值越大,则所得曲线下面积(Area-under-the-curve,AUC)越接近1.00,此比值接近1.8时AUC约0.95.以突变体与起始物的酶活性浓度差值超过起始物标准差1.4倍为阈值,能识别催化效力达起始物1.8倍以上的突变体.因此,用XOAHP法测定裂解液中尿酸酶活性,以起始物活性均值加标准差1.4倍为阈值,有望高通量筛选尿酸酶突变体库.
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- 关键词：尿酸酶突变体高通量筛选ROC曲线
