黑龙江省教育厅资助项目(11521022)
- 作品数：7 被引量：23H指数：3
- 相关作者：任桂萍李德山张巧王文飞徐黎明更多>>
- 相关机构：东北农业大学黑龙江八一农垦大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省教育厅资助项目哈尔滨市科技创新人才研究专项资金黑龙江省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 可溶性重组hTRAIL蛋白抑制U251细胞生长
- 2011年
- 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族中的成员,能够广泛诱导肿瘤细胞凋亡,对正常细胞无明显毒副作用.TRAIL已成为肿瘤治疗领域的研究热点.人脑胶质瘤是神经系统肿瘤中最常见类型,占颅内肿瘤50%～60%,5年存活率为20%～30%.本研究探讨可溶性TRAIL蛋白对人脑胶质瘤细胞(U251)的抑制作用.由大肠杆菌表达系统表达的TRAIL多为包涵体,为获得可溶性的蛋白,将hTRAIL95～281功能区基因片段插入到pHisSUMO表达载体,经IPTG低温诱导表达,Ni-NTA Agarose纯化后获得可溶性SUMO-hTRAIL,经SUMO ProteaseⅠ切去SUMO融合标签后获得成熟可溶hTRAIL蛋白.以U251细胞为靶细胞,通过MTT法检测TRAIL对肿瘤细胞的抑制作用.结果证明,TRAIL对U251细胞的抑制呈剂量依赖关系,最大抑制率为53.9%.流式细胞仪检测TRAIL诱导U251细胞凋亡实验中,对照组细胞存活率为92.2±0.8%,实验组细胞存活率为35.5±1.2%,证明重组蛋白具有生物学活性,并在体外能明显诱导U251肿瘤细胞发生死亡.本研究结果为TRAIL蛋白在临床上应用于肿瘤治疗奠定了基础.
- 颜世君吴云舟高振秋叶贤龙张巧何金娇任桂萍李德山
- 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体SUMO肿瘤治疗
- 新型抗IL-1β和IL-17A双特异抗体的构建及特性鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）具有双重的生物学功能。本实验旨在设计并原核表达抗人IL-1β和抗人IL-17A的双特异性抗体（BsAb1／17），获得具有生物活性的BsAb1／17，为深入研究和利用双特异性抗体奠定基础。方法利用重叠PCR方法构建VH1VL17-CL和VL1VH17-CH1基因片段，并且在所用引物的5’和3’端附加NcoI和BamHI的酶切位点。将重叠PCR产物进行胶回收后用NcoI／BamHI进行双酶切，酶切产物再次胶回收，将其连接到用NcoI／BamHI消化的pET-27b载体上。将重组质粒pET-27b—VH1VL17-CL（petA）和pET-27b—VLIVH17-CH1（petB）转化到Eco1iRosetta中。SDS—PAGE和Westernb1ot进行鉴定，用rea1—timePCR检测其阻断IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-1β的活性，人IL-6定量酶联检测试剂盒检测其阻断IL-17A刺激HeLa细胞表达人IL-6的活性。结果DNA测序结果证明成功构建了pET-27b-VHIVL17-CL（petA）和pET-27b-VL1VH17-CH1（petB）表达质粒。petA、petB诱导产物主要以包涵体形式存在，成熟蛋白纯化产物纯度超过90％以上，经SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量约为38×10^3，与理论值相符。Western b1ot和ELISA结果证实双特异抗体BsAb1／17对IL-1β和IL-17A均具有很好的亲和力。通过RT-PCR检测证明其具有阻断IL-1β刺激人T细胞大量表达细胞因子IL-1β的活性，并且具有阻断IL-17A刺激HeLa细胞产生IL-6的活性。结论成功构建了同时抗IL-1β和IL-17A的双特异抗体，并利用大肠杆菌表达系统高效表达较高纯度的具有生物活性的双特异抗体。
- 王秋颖徐黎明任桂萍彭中宜丁良君孙阳陈睿李德山
- 关键词：双特异性抗体
- 限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺被引量：1
- 2011年
- 目前有关限制性内切酶NotⅠ的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化NotⅠ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在。为探索限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺,从豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidis-caviarum)中克隆出限制性内切酶NotⅠ的基因并使之在大肠杆菌中高效表达。首先将由成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)中克隆所得甲基化酶EagⅠM(EagⅠmethylase gene)基因连接到pBR322载体上,转化大肠杆菌ER2566,将豚鼠耳炎诺卡菌中克隆所得的限制性内切酶NotⅠR(NotⅠrestriction endonuclease gene)基因连接到表达载体pACYC184-PT7上,将此重组质粒转化到上述已转入甲基化重组质粒pBR322-EagⅠM的ER2566中,构建成NotⅠ蛋白表达菌ER2566[pBR322-EagⅠM,pACYC184-PT7-NotⅠR]。重组工程菌经IPTG诱导可表达限制性内切酶NotⅠ,并对诱导条件进行优化使之以可溶形式高效表达。应用KTA purifier 100蛋白纯化系统,对纯化工艺进行创新,通过DEAE Sephrose FF离子交换层析、phenyl HP疏水层析和Superdex 75 10/300GL分子筛层析对蛋白进行提纯。纯化后NotⅠ经酶活力及纯度鉴定,其比活力为1.37×106U/mg,提纯35倍,得率为17.8%,产量达9.8×106 Units/g wet cell,提纯时间缩减为原来的1/10,在产量和效率上较以前报道均有很大提高。该纯化工艺的新方法,为实验室制备及工业化生产Ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。且该酶的成功获得为后续研究提供了材料,为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考。
- 张巧叶贤龙任桂萍张楠李璐李德山
- 关键词：I克隆纯化
- 筛选糖尿病候选药物FGF-21受体激动剂的新型细胞模型的建立被引量：3
- 2011年
- 建立以成纤维细胞生长因子-21(fibroblast growth factor-21,FGF-21)信号通路为靶点的药物筛选细胞模型,用于筛选FGF-21受体激动剂类的新型治疗糖尿病药物。FGF-21的生理功能主要是通过细胞表面的FGFR及辅助受体βklotho传递信号,从而激活细胞内相关调控的一系列信号通路以及基因转录来实现的。本实验将βklotho基因构建到逆转录病毒表达载体pBMN-IRES-EGFP。将该载体导入包装细胞,收集病毒上清液并感染3T3-L1细胞,筛选到稳定表达βklotho细胞系。该细胞模型在FGF-21作用下可以促进细胞葡萄糖转运蛋白-1表达及转运水平升高,从而提高细胞糖吸收能力。构建该细胞系可以方便对FGF-21及类似药物进行高通量筛选,为糖尿病药物的研究提供了一种新方法。
- 高红梅王文飞张巧韩阳王琪任桂萍付云威李德山
- 关键词：FGF-21药物筛选糖尿病药物
- FGF21-L-Fc融合蛋白表达及其降糖作用初步评价被引量：4
- 2011年
- 成纤维细胞生长因子-21(FGF21)是FGF家族成员之一,最近发现具有独立调节血糖的作用。为了提高FGF21稳定性来达到更好的药效,通过柔性接头连接,制备重组融合蛋白FGF21-L-Fc,并对其生物学活性和体内药效学进行初步研究。纯化后的FGF21-L-Fc融合蛋白经鉴定,其分子量和特异性均与理论值相符。经微量化的GOD-POD法检测表明,FGF21-L-Fc融合蛋白能刺激体外培养的已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖吸收,其葡萄糖消耗率与野生型相比有很大提高;在STZ造模糖尿病小鼠体内,其药效比野生型持续时间长。结果表明,改造的蛋白比野生型药效更持久,为以后FGF21的临床应用奠定了基础。
- 姚文兵任桂萍韩阳曹宏伟高红梅阚方明王琪李德山
- 关键词：葡萄糖吸收稳定性
- 酵母展示筛选scFv方法的建立被引量：7
- 2009年
- 目的:利用酵母展示技术建立筛选scFvs的技术平台,为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础。方法:改造pYD1载体,将其自身所带的GSLinker上下游两端突变出酶切位点,构建成pYD-x;分别将IL-1β抗体的重链与轻链可变区片段插入pYD-x中GSLinker的上下游,构建出重组质粒pYSD1。从pYSD1上PCR扩增出scFv片段,并将其插入pYD1的MCS区,构建出重组质粒pYSD2。将pYSD1与pYSD2分别转入酿酒酵母EBY100中诱导表达scFv,并用流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况。结果:经诱导后,从流式细胞仪检测结果中可以看出EBY100-pYSD1所展示的scFv与抗原结合力很弱,而EBY100-pYSD2则表现出一定强度的结合。结论:本实验证明了pYD-x载体上存在的额外的GSLinker对于抗体展示的必要性,并且成功建立了利用酵母展示载体pYD1进行scFvs筛选的技术平台。
- 尹成凯徐黎明任桂萍张巧刘向宇田辉李德山
- 关键词：SCFVGSLINKER
- 人FGF-21基因的克隆、表达及其调节脂肪细胞糖代谢的活性被引量：7
- 2010年
- 成纤维细胞生长因子FGF-21是FGF家族的一个新成员,最近的研究发现其具有调节血糖的作用,有望成为治疗2型糖尿病的基因药物。文章应用RT-PCR技术,从成人肝脏中克隆人源的FGF-21成熟蛋白基因,并将其克隆到T载体上,经测序鉴定后,将其亚克隆到原核表达载体pSUMO上,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中。鉴定阳性克隆后,用IPTG诱导FGF-21表达,并用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化。以3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收实验来鉴定FGF-21表达产物促进糖吸收的活性。结果表明,FGF-21成熟蛋白基因大小为546bp,测序结果与GenBank数据库中的序列一致。SDS-PAGE与Western blotting结果表明:人源FGF-21成熟蛋白大小19.4kDa,经3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收实验验证其具有促进葡萄糖吸收的生物活性,并且GLUT1是FGF-21发挥生物学作用的终末执行单位。
- 侯玉婷李晋南任桂萍刘铭瑶孙国鹏王文飞李德山
- 关键词：成熟蛋白糖尿病
