国家自然科学基金(30170925)
- 作品数：30 被引量：135H指数：7
- 相关作者：严律南潘光栋陈琳赵永恒王新平更多>>
- 相关机构：四川大学华西医院广西医科大学江苏省人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金广西壮族自治区自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的构建及其应用的初步研究被引量：2
- 2003年
- 目的 构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒并转染人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药的基因治疗提供实验研究基础。方法 将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack CMV上 ,与骨架质粒在细菌体内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp ,再用其转染人肝癌耐药细胞株SMMC 772 1 /ADM。结果 成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒 ,病毒滴度为 2 .5× 1 0 9efu/ml,多重感染复数为 1 0 0时对SMMC 772 1 /ADM细胞株转导效率可达 90 %以上。结论 构建的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp可望有效地将反义MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药机理及其逆转方式的研究提供实验基础。
- 陈琳苟兴华严律南赵永恒韩蕾李德华胡海洋赵兰英
- 关键词：多药耐药相关蛋白重组腺病毒反义RNA技术肝癌
- 短发夹RNA／mdr1表达载体的构建及体外表达被引量：3
- 2007年
- 目的构建短发夹RNA（shRNA）／mdr1的质粒表达载体并验证其体外表达效率。方法按照pSUPER的设计要求合成mdr1基因RNAi靶序列的64bp寡核苷酸序列，退火后双酶切法（BglⅡ和HindⅢ）克隆，得到质粒pSUPER-shRNA／mdr1，转染感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，测序证实后扩增培养并提取，然后转染融合达90％以上的HepG2／mdr1细胞，阴性载体为对照组，实时聚合酶链反应（Real-timePCR）、流式细胞术检测mdr1基因mRNA、P-gp表达、细胞耐药性等功能变化。结果成功构建质粒载体pSUPER-shRNA／mdr1，基因测序证实靶序列插入正确；HepG2／mdr1-si组mdr1基因的mRNA表达水平是耐药株HepG2／mdr1组的56分之一；HepG2／mdr1-si组细胞和阴性对照组HepG2／mdr1细胞的P-gP表达率分别为11.0％和98．6％，P〈0．05；HepG2／mdr1组细胞耐药倍数从62．5下降到1．4，相对逆转效率99．34％；细胞内DNR累积量也明显增加，与对照组比较（79．32％比37．96％），P〈0．05。结论多药耐药基因mdr1质粒表达载体pSU-PER-shRNA／mdr1能在HepG2／mdr1内稳定表达，并逆转其耐药性。
- 潘光栋严律南夏冬杨家印夏庆杰闫乃红陈清英
- 关键词：多药耐药基因质粒
- shRNA／mrp1表达载体构建及其体外表达研究被引量：1
- 2010年
- 目的构建shRNA／mrp1的质粒表达载体并验证其体外表达效率。方法根据业已筛选出的mrp1基因RNAi靶序列，按照pSUPER的设计要求合成64bp的寡核苷酸序列，将其退火后形成双链并用双酶切法克隆到pSUPER得到质粒pSUPER-shRNA／mrp1，转染感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，经测序证实后扩增培养并以去内毒素试剂盒提取，然后转染HepG2／mrp1细胞，阴性载体为对照组，Real—time PCR、流式细胞术检测mrp1基因mRNA、MRP1表达、细胞耐药性等功能变化。结果成功构建质粒载体pSUPER—shRNA／mrp1，经基因测序证实靶序列插入正确；HepG2／mrp1组Ct值较GAPDH增加5．61，HepG2／mrp1—si组Ct值比GAPDH升高11．35，mrp1基因的表达水平是耐药株HepG2／mrp1的179分之一；实验组HepG2／mrp1细胞和阴性对照组HepG2／mrp1细胞的MRP表达率分别为11．2％和97．6％，差别有统计学意义（P〈0．05）；药物敏感试验显示HepG2／mrp1细胞耐药倍数从45．0下降到1．2，相对逆转效率99．62％；细胞内DNR累积量也明显增加，与对照组比较（78．58％vs38．44％，P〈0．05）。结论成功构建质粒载体pSUPER-shRNA／mrp1，在HepG2／mrp1内稳定表达，逆转其耐药性。
- 潘光栋严律南杨建青褚光平刘强肖亿
- 关键词：基因表达多药耐药
- RNA干扰逆转肝癌多药耐药被引量：4
- 2011年
- 目的研究siRNA对肝癌耐药细胞系HepG2／mrp1中多药耐药相关蛋白基因（multi—drug-resistant-associated1，mrp1）及其蛋白产物MRP1表达的抑制作用和逆转其耐药性的效果。方法设计合成针对mrp1启动子区域的RNA干扰小片段，转染肝癌耐药细胞HepG2／mrp1。通过RT-PCR和流式细胞仪，在mRNA和蛋白质水平评估RNA干扰对mrp1表达的影响；MTT法检测RNA干扰逆转HepG2／mrp1细胞多药耐药性的变化，按照实验组和亲本组细胞的半数抑制剂量（IC30）评估RNA干扰对细胞耐药倍数的改变。结果在耐药细胞HepG2／mrp1中，RNA干扰明显抑制了mrp1mRNA和蛋白产物MRP1的表达水平，在相同浓度药物作用下实验组细胞耐药性显著下降。结论我们设计的siRNA对肝癌耐药细胞HepG2／mrp1中的mrp1基因有显著的抑制作用，具有良好的逆转多药耐药性的效果。
- 王新平严律南李德华苟兴华潘光栋夏冬刘江文严茂林阎乃红陈清英
- 关键词：多药耐药肝癌RNA干扰多药耐药相关蛋白
- 携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒微球的构建
- 2008年
- 目的构建携带反义多药耐药相关蛋白（MRP）基因的重组腺病毒微球并进行理化性质的鉴定，以用于肝癌多药耐药的基因治疗研究。方法采用可降解的生物材料聚乳酸-聚乙烯醇（PELA）包被携带反义MRP基因的重组腺病毒制成微球，体外测定微球的粒径、载病毒量、包封率及释放规律，并用其转染人肝癌耐药细胞株HepG2／ADM，48h及120h后检测转染细胞荧光强度。结果成功地构建了携带反义MRP基因的重组腺病毒微球，直径约1．765μm，包封率为52．4％，载病毒率为5．5
×10^8 efu／mg，在120h内释放病毒量为49．2％，总的释放时间长于240h。释放出的病毒保持活性，10mg微球48h释放病毒滴度为1．0×10^9efu／ml，对HepG2／ADM细胞株转导效率可达90％以上。结论聚乳酸-聚乙烯醇共聚物（PELA）包载反义RNA重组腺病毒制备的微球，包封率较高，载病毒量较大，能保持病毒活性，较长时间释放，转导效率高，可望有效地将反义MRP导入人肝癌耐药细胞株，为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础。
- 余少鸿王晓波严律南周绍兵陈永兵
- 关键词：基因治疗反义RNA重组腺病毒微球多药耐药相关蛋白
- RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药被引量：7
- 2008年
- 目的筛选高效dsRNA/mdr1,以备研究RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药之用。方法首先根据siRNA设计原则,以多药耐药基因(mdr1)为靶基因,设计并选择4~5条siRNA/mdr1,经BLAST后体外转录法合成dsRNA/mdr1,用Oligofectamine试剂分别转染HepG2/mdr1,然后从mRNA、蛋白(P-gp)表达水平和细胞功能变化评价HepG2/mdr1耐药性被逆转的程度,比较各个dsRNA/mdr1的逆转效率,筛选出有效的siRNA/mdr1。结果成功合成5条dsRNA/mdr1(其中1条为阴性对照),dsRNA/mdr1-4mRNA表达(18.73±1.33)%、蛋白表达变化(79.1±1.6)%^(16.8±0.4)%与其他各组细胞比较,有显著性差异;细胞内柔红霉素(DNR)累积量也较其他组明显增加(平均荧光强度79.58,阳性率84.25%,P<0.05)。结论体外转录法结合脂质体转染适用于筛选高效siRNA,肯定了siRNA干扰序列能够有效阻抑mdr1基因编码蛋白p170的功能。
- 潘光栋严律南王新平杨家印夏庆杰闫乃红陈清英张发强
- 关键词：肝细胞癌多药耐药RNA干扰
- 重组腺病毒介导MRP反义RNA逆转人肝癌细胞多药耐药表型的体外实验研究被引量：13
- 2005年
- 目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白(MRP)反义RNA对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒(Ad-Asm rp),在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞对阿霉素(ADM)及柔红霉素(DNR)的半数致死量(IC50)并计算耐药倍数(RF值);在转染后不同时间点用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P190表达、并用RT-PCR反映细胞MRP之mRNA水平的变化。结果携带MRP反义RNA的重组腺病毒转染后的人肝癌耐药细胞对ADM、DNR的IC50分别为0.487μg/m l、0.328μg/m l,RF值分别为97.4、109.3,RF值分别下降36.8和35.4。在转染后24 h,MRP mRNA水平开始下降并呈持续下降趋势(P<0.01),48 h后伴有P190蛋白表达的持续下降(P<0.01),二者趋势一致。转染后48 h,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度明显上升(P<0.01)。结论重组腺病毒介导的MRP反义RNA可有效封闭MRP基因表达,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的MDR表型有较好的逆转作用。
- 陈琳严律南苟兴华李德华韩蕾
- 关键词：重组腺病毒MRP基因表达多药耐药相关蛋白重组腺病毒介导人肝癌细胞体外实验研究反义RNA
- 系统免疫炎症指数和骨骼肌质量指数与肝硬化合并肝癌患者术后预后的关系被引量：13
- 2020年
- 目的:探讨系统免疫炎症指数(SII)和骨骼肌质量指数(SMI)与肝硬化合并肝癌患者术后预后的关系。方法:选取2015年1月至2017年12月我院收治的128例肝癌合并肝硬化患者。比较不同水平SII和SMI组患者临床病理特征和预后,分析影响肝硬化合并肝癌患者术后预后的危险因素。结果:术前SII高水平组的BCLC分期、脉管癌栓占比、低分化占比高于低水平组,差异均有统计学意义(P<0.05)。术前SMI高水平组的年龄、美国麻醉医师协会分级、BCLC分期、肿瘤个数、脉管癌栓占比均低于或少于低水平组,差异有统计学意义(P<0.05)。术前SII低水平组1年、2年、3年累积总生存率分别为90.8%、75.5%、47.3%,术前SII高水平组1年、2年、3年累积总生存率分别为70.7%、58.2%、39.1%,差异有统计学意义(P=0.045)。术前SMI低水平组1年、2年、3年累积总生存率分别为73.3%、55.3%、34.8%,术前SMI高水平组1年、2年、3年累积总生存率分别为90.4%、77.8%、49.7%,差异有统计学意义(P=0.010)。Cox多因素分析结果显示,BCLC B-C期、多发肿瘤、低分化、脉管癌栓、术前高水平SII是患者术后预后的独立危险因素(P<0.05),根治性切除和术前高水平SMI是其独立保护因素(P<0.05)。结论:术前SII和SMI水平与肝硬化合并肝癌患者预后密切相关,高水平SII是其独立危险因素,而高水平SMI是其独立保护因素。
- 任莎莎简文刘自明
- 关键词：肝癌肝硬化预后
- 携反义m rp和m dr1双耐药基因的重组腺相关病毒载体的构建与鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的构建携带反义多药耐药相关蛋白基因(m rp)和反义多药耐药基因(m dr1)双耐药基因的重组腺相关病毒载体,以用于逆转肝细胞癌(HCC)多药耐药(M DR)的研究。方法将m rp基因cDNA 5′端500 bp的基因片段与m dr1基因cDNA 5′端600 bp的基因片段,用基因片段重叠法连接成为新的基因片段(m rp+m dr1),并反向克隆到重组腺相关病毒载体系统(AAV H e lper-F ree System)表达质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建出重组表达质粒pAAV-IRES-hrGFP-(m rp+m dr1)AS;再将pAAV-IRES-hrGFP-(m rp+m dr1)AS与AAV H e lper-F ree System中的控制质粒pAAV-RC和辅助质粒pH e lper用脂质体转染法共转染293细胞,生成新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp+m dr1)AS。结果成功构建并包装出新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp+m dr1)AS,病毒滴度达2.5×108efu/m l。结论构建的rAAV 2-(m rp+m dr1)AS可望能将反义m rp和m dr1基因片段导入HCC耐药细胞株。
- 张明满李德华严律南苟兴华赵永恒苏芝黄迎春韩蕾赵兰英胡海洋
- 关键词：反义RNA技术重组腺相关病毒
- 携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建被引量：6
- 2003年
- 目的 构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法 将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果 成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论 构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 。
- 陈琳苟兴华严律南韩蕾李德华赵永恒胡海洋
- 关键词：反义RNA技术多药耐药多药耐药相关蛋白重组腺病毒基因治疗
