将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用Real-ti me PCR技术对外周血单个核细胞(PBMC)中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎细胞因子的mRNA表达进行定量分析。结果表明,病毒感染后,PRRSV感染组、PCV2感染组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平均上调,其中PRRSV感染组的IL-6、IL-8显著上调,PCV2感染组的IL-6、IL-8和TNF-α显著上调;PRRSV/PCV2共感染组仅有IL-8和TNF-α的mRNA表达水平上调且差异显著;并且,PRRSV/PCV2共感染组IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达水平均低于单独感染组,仅TNF-α的mRNA表达水平显著高于单感染组。结果提示,TNF-α的过量表达可能在PRRSV和PCV2协同致病机制中扮演重要角色。
将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductine and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用real-ti me PCR技术对外周血单个核细胞(PBMC)中的病毒载量以及Fas、FasL、TNFR1和TNF-α等凋亡细胞因子mRNA表达水平进行检测,采用流式细胞术对PBMC的凋亡比率进行检测。结果显示,PRRSV/PCV2共感染组PBMC中PRRSV和PCV2载量、PB-MC凋亡比率均显著高于PRRSV感染组或PCV2感染组。所有病毒感染组的Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的mRNA表达水平均显著上调,并且PRRSV/PCV2共感染组的表达水平均显著高于单感染组。结果表明,Fas/FasL、TNFR1/TNF-α表达水平的显著上调可能在PRRSV和PCV2协同诱导凋亡机制中扮演重要角色。
为探讨PRRSV感染后机体的体液免疫应答、从分子水平深入研究PRRSV的免疫机制,本研究针对Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-4、IL-6、IL-10及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。该方法线性关系好,各种细胞因子及β-actin标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染仔猪外周血单个核细胞(PBMC)中IL-4、IL-6和IL-10mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的real-timePCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪Th2型细胞因子的检测及定量分析。
将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用实时定量PCR(Real-ti me PCR)对血清、组织(心、肝、肺、肾、胰、脾、胸腺、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结)中的PRRSV和PCV2载量进行检测,分别采用间接ELISA和间接IFA对血清中的PRRSV和PCV2特异性抗体进行检测,采用MTT法对猪外周血淋巴细胞(PBLC)的增殖能力进行检测。结果,PRRSV/PCV2共感染组血清、组织中PRRSV的载量均显著高于PRRSV单感染组,PCV2的载量均显著高于PCV2单感染组;共感染组PRRSV和PCV2特异性抗体阳转的时间均晚于并且效价均显著低于PRRSV或PCV2单感染组;共感染组和单感染组PBLC的增殖能力均受到抑制,其严重程度依次为:PRRSV/PCV2组>PRRSV组>PCV2组。由此表明,PRRSV和PCV2在猪体内对彼此的增殖具有促进作用;PRRSV和PCV2共感染对猪的免疫抑制具有加重作用。
