国家自然科学基金(30872574)
- 作品数：5 被引量：8H指数：2
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- 靶向大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定被引量：4
- 2011年
- 目的构建携带增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）标志针对大鼠诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因的shRNA重组腺病毒载体并在人胚肾-293细胞中扩增制备重组病毒。方法利用AdMax包装系统，用先期构建的带有EGFP标记基因的穿梭质粒pDC316-iNOS—shRNA—EGFP，与骨架质粒pBHG1α—E1，3Cre共转染293包装细胞，同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-inos—shRNA—EGFP，反复感染293细胞扩增病毒后，离子交换法纯化病毒，并测定病毒颗粒数及滴度。结果经聚合酶链反应（PCR）检测和EGFP表达证明已成功构建了携带iNOS-shRNA—EGFP的重组腺病毒载体；扩增纯化后，测得重组腺病毒颗粒数为3．6×10^11VP／ml，A260／A280值约为1．25，病毒活性为7．94×10^9IU／ml。结论已成功构建重组腺病毒载体Ad5-inos—shRNA—EGFP，为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究奠定实验基础。
- 袁慧星王涛饶可李明超李路刘继红叶章群
- 关键词：诱导型一氧化氮合酶腺病毒载体增强型绿色荧光蛋白
- 大鼠诱导型一氧化氮合酶短发夹环RNA质粒的构建及鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的:构建编码诱导型一氧化氮合酶(iNOS)启动子的shRNA质粒表达载体,为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究做准备。方法:根据大鼠iNOS启动子序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pDC316-EGFP-U6,构建重组质粒,并进行PCR鉴定以及测序分析。结果:PCR鉴定以及测序证实重组质粒构建成功。结论:成功构建了靶向iNOS基因的shRNA质粒表达载体,为进一步探索勃起功能障碍基因治疗奠定了基础。
- 袁慧星王涛饶可李明超李路詹鹰刘继红
- 关键词：勃起功能障碍诱导型一氧化氮合酶短发夹环RNA
- 腺病毒介导的小激活RNA基因治疗对老龄大鼠阴茎勃起功能的改善被引量：1
- 2017年
- 目的探讨靶向大鼠iNOS基因的shRNA重组腺病毒载体对老龄大鼠阴茎海绵体iNOS基因的激活作用,为勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法 24月龄SD大鼠30只随机分为3组,注射重组腺病毒Ad5-iNOSshRNA-EGFP(AdU6/shiNOS)组10只,注射对照病毒(AdU6/shControl)组10只,空白对照组10只注射PBS。注射1周后采用电刺激下检测阴茎海绵体压力和平均动脉压比值(ICP/MAP)的方法评估阴茎勃起功能,收集阴茎海绵体组织,采用real-time PCR半定量检测iNOS mRNA的表达,Western blot检测iNOS蛋白表达。结果在2.5、5.0和7.5V电压刺激时,AdU6/shiNOS组大鼠ICP/MAP均高于AdU6/shControl组和空白对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);注射AdU6/shiNOS组海绵体组织中iNOS的mRNA和蛋白表达水平均明显高于AdU6/shControl组和空白对照组(均P<0.05)。结论利用腺病毒介导的RNA激活技术能提高海绵体iNOS基因表达,改善老龄大鼠的勃起功能。
- 袁慧星周炳炎矫阳田汪道奇徐浩李明超王涛刘继红
- 关键词：勃起功能障碍基因治疗INOS老龄大鼠
- 腺病毒介导的激活大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中NO/cGMP通路的实验研究被引量：3
- 2013年
- 目的:探讨靶向大鼠iNOS基因的shRNA重组腺病毒载体对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iNOS基因的激活作用,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法:将前期构建的重组腺病毒Ad5-iNOSrshRNA-EGFP(AdU6/shiNOS)和对照病毒AdU6/shControl,分别转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,分别在不同病毒MOI(25,50,75)值下72小时后采样检测。采用realtime RT-PCR半定量检测AdU6/shiNOS对细胞iNOS基因mRNA表达影响;Western-blot法检测海绵体平滑肌细胞iNOS蛋白表达变化。然后培养基中加LArg(10mmol/L),用酶联免疫法检测病毒转染72小时后海绵体平滑肌细胞内cGMP的浓度变化,记录AdU6/shiNOS对平滑肌细胞内cGMP的影响。结果:AdU6/shiNOS转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞72小时后,和空白对照组、阴性对照组相比iNOS基因在mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05),呈剂量依赖性,MOI=75时RNAa效果最好。而且转染72小时后,实验组原代平滑肌细胞内cGMP水平显著高于对照组及空白组(P<0.05)。结论:利用腺病毒介导的RNAa技术,提高海绵体平滑肌细胞iNOS基因表达获得成功,可以增加阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平,激活了NO/cGMP通路,这为勃起功能障碍的基因治疗研究开辟了新的方向。
- 袁慧星王涛詹鹰王少刚刘继红叶章群
- 关键词：勃起功能障碍基因治疗INOS基因
- 小激活RNA介导的大鼠肝细胞株BRL中诱导型一氧化氮合酶上调表达的研究被引量：2
- 2010年
- 目的 应用RNA激活技术激活大鼠肝细胞株BRL中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表达,筛选出有效的激活序列,进一步证明了该现象普遍存在于哺乳动物细胞中.方法 设计并合成了4条靶向大鼠iNOS基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子（saRNA-1、saRNA-2、saR-NA-3及saRNA-co）,脂质体法转染BRL细胞.转染后收集转染后细胞,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测iNOS的表达.结果大鼠肝细胞株BRL转染羟基荧光素（FAM）标记的saRNA后,70%以上细胞内有绿色荧光表达.转染72 h半定量RT-PCR检测显示saRNA-2转染后能够激活BRL细胞iNOS基因的表达,其他saRNA转染后未见激活现象.结论 利用RNA激活技术可成功激活大鼠肝细胞BRL细胞株iNOS基因的表达.
- 袁慧星饶可宋国颖王涛詹鹰刘继红
- 关键词：一氧化氮合酶
