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三维无血清条件培养结合抗癌药物分离人骨肉瘤肿瘤干细胞被引量：4: 2010年; 目的探讨无血清三维条件培养结合抗癌药物分离及鉴定人骨肉瘤肿瘤干细胞的可行性。方法将来源于人体的骨肉瘤细胞种植于1.2%藻酸盐凝胶中,并置于添加有阿霉素(Epirubicin,0.8μg/ml)的无血清DMEM/F12条件培养基中培养。培养7～10天后,可见凝胶内出现由单细胞增殖形成的单克隆球。取出该单克隆球,并通过细胞免疫荧光(Oct3/4和Nanog)、体内致瘤实验,检测该单克隆球细胞的生物特性。结果单克隆球主要由Oct3/4和Nanog阳性细胞组成,这些阳性细胞具有明显的致瘤作用。结论分离所得的单克隆细胞既能表达部分干细胞基因(Oct3/4和Nanog),又表现出明显的抗肿瘤药物性和体内致瘤性,三维无血清条件培养结合抗癌药物分离所得的单克隆骨肉瘤细胞可能为人骨肉瘤干细胞。; 周松李锋肖骏熊伟方忠陈文坚牛鹏彦; 关键词：无血清培养阿霉素骨肉瘤肿瘤干细胞

藻酸钠微球培养对兔髓核细胞生物学特性的影响: 2009年; 目的探讨藻酸钠微球培养对兔椎间盘髓核细胞(NPCs)体外生物学特性的影响。方法4月龄健康新西兰大耳白兔6只,取髓核细胞原代培养,传代后分为实验组(藻酸钠微球培养)和对照组(平面培养),通过倒置相差显微镜对髓核细胞进行形态学观察,MTT法测定两组髓核细胞增殖情况,运用RT-PCR技术检测两组髓核细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果经过2周的培养,两组髓核细胞增殖率无明显差异;藻酸钠微球培养组在Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达上均高于平面培养组(P<0.01或P<0.05)。结论藻酸钠微球培养法能促进髓核细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达,在维持其表型稳定方面优于平面培养法。; 陈文坚李锋陈安民; 关键词：髓核细胞表型

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能被引量：1: 2009年; 背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记。目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力。设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行。材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导。主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能。结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞成骨诱导21d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积。结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能。; 陈文坚李锋周松陈安民; 关键词：骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白成骨成脂

腰椎融合术后邻近节段退化的系统回顾分析被引量：9: 2012年; 目的探讨腰椎融合术导致融合邻近节段退化(ASDet)发生的概率、发病机制及危险因素。方法通过计算机检索和人工检索,对近30年来国内外发表的关于腰椎融合术导致邻近节段退化的文献进行系统回顾。结果共搜索到301篇相关文献,筛选出30篇符合入选标准的文献。本研究发现ASDet发病率波动在6.3%～100%,邻近节段退变(ASDeg)发病率波动范围8%～100%,邻近节段疾病(ASDis)发病率波动范围6.3%～27.4%。ASDeg平均发病率高于ASDis,P=6.751×10-7(P<0.05)。多种影响因素参与ASDet的发生。结论 ASDet、ASDeg、ASDis发病率差异较大。目前ASDet发生的机制仍不明,绝大多数学者认为与手术引起的邻近节段生物力学机制改变有关。年龄大于60岁、使用内固定器械、损伤上方小关节、改变腰椎前凸和骶倾角、破坏腰椎后方组织结构、已绝经妇女是邻近节段退化性疾病发生的危险因素。然而长节段融合是否导致ASDet的发病率增高还有待进一步研究。; 沈凯李锋谭祖健; 关键词：腰椎融合术邻近节段退变发病率

转染Ad-hBMP2的脂肪干细胞与壳聚糖/磷酸三钙复合物支架的相容性被引量：3: 2012年; 目的探讨转染腺病毒骨形态发生蛋白(Ad-hBMP2)基因的脂肪干细胞(ADSCs)与壳聚糖/磷酸三钙(CTCP)复合物支架的相容性,以期为ADSCs修复骨缺损寻找理想的组织工程骨支架材料。方法将壳聚糖与磷酸三钙进行复合制成CTCP复合物材料,再将其与转染Ad-hBMP2的ADSCs(密度1×106/mL)复合培养,进行细胞复合物支架的一般与超微形态学观察,观察细胞粘附能力、增殖活力,RT-PCR及Western blot测定成骨细胞骨钙素和Ⅰ型胶原水平。结果 CTCP支架孔径200～350μm,孔隙率83%;电镜显示转染Ad-hBMP2的ADSCs与CTCP复合物在体外培养期间支架无塌陷及形变,且其在支架上粘附、增殖良好,并能分泌细胞外基质如骨钙素和Ⅰ型胶原等;随着培养时间延长,骨的组织学特征日益明显。结论 CTCP支架具有适宜的孔结构和良好的生物相容性及骨诱导作用,可以作为骨组织工程较理想的支架材料,且与转染Ad-hBMP2的ADSCs相结合更易形成组织工程骨。; 方忠杨琴熊伟李光辉廖晖李锋肖骏; 关键词：脂肪干细胞

Differentiation of Mesenchymal Stem Cells into Nucleus Pulposus Cells In Vitro被引量：9: 2008年; To find a new source of seed cells for constructing tissue-engineered intervertebral disc,nucleus pulposus(NP) cells and mesenchymal stem cells(MSCs) were isolated from New Zealand white rabbits.The nucleus pulposus cells population was fluorescence-laelled and co-cultured with MSCs with or without direct contact.Morphological changes were observed every 12 h.Semi-quantitaive reverse transcriptase-polymerase chain reaction was performed to assess the expression levels of Sox-9,aggreacan and type Ⅱ collagen every 24 h after the co-culture.MSCs treated with direct contact rounded up and presented a ring-like appearance.The expression of marker genes was significantly increased when cells were co-cultured with direct contact for 24 h.No significant change was found after coculture without direct contact.Co-culture of NP cells and MSCs with direct contact is a reliable method for generating large amount of NP cells used for cell-based tissue engineering therapy.; 陶凤华李锋李光辉潘锋; 关键词：间叶细胞神经核转录酶聚合酶

剪切力对间充质干细胞的细胞休眠状态的诱导作用: 2015年; 目的探讨层流剪切力(LSS)对间充质干细胞(MSCs)增殖和凋亡的影响。方法选择间充质干细胞(MSCs),并对其进行体外流体剪切力力学加载(生理范围内);通过DNA合成了解增殖情况,采用流式细胞仪及PCR技术检测其凋亡情况。结果在生理范围内的流体力学加载,细胞增殖与其加载力相关;该范围内的力学刺激对MSCs的凋亡起抑制作用。结论生理范围内的流体剪切力诱导MSCs进入休眠状态。; 罗伟李锋熊伟高仕长; 关键词：间充质干细胞剪切力凋亡

腺病毒介导转染人生长转化因子β1的脂肪干细胞复合多孔β-磷酸三钙支架体外培养的研究被引量：4: 2011年; 目的观察腺病毒介导转染人生长转化因子β1（Ad—hTGF—β1）的脂肪干细胞（ADSCs）与多孔β-磷酸三钙（β-TCP）支架材料在体外复合培养，探讨它们之间的相容性以及其构建组织工程软骨的可行性。方法含增加型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的腺病毒表达载体pAd—hTGF-β1，经包装、转染兔脂肪干细胞，筛选出成功转染Ad—hTGF-β1的ADSCs，然后将携Ad—hTGF—β1的ADSCs（密度1×10^6个／m1）与多孔β-磷酸三钙支架中行三维立体复合培养，定期扫描电镜观察细胞黏附能力、增殖活力以及形态学改变，并通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot法和免疫组织化学法检测软骨特异性细胞外基质蛋白Ⅱ型胶原蛋向（CollagenⅡ）的表达。结果多孔β—TCP支架孔径在300～450μm之间，孔隙率65％；扫描电镜显示Ad—hTGF-β1的ADSCs与β—TCP支架材料在体外培养期间支架无塌陷及形变，且在支架上黏附、增殖良好，并能分泌软骨细胞外基质collagen Ⅱ，其分泌随时间呈增加的趋势。结论多孔β—TCP支架具有适宜的微孔结构、良好的生物相容性和软骨诱导作用，可以作为软骨组织工程较理想的支架材料。且其与转染Ad—hTGF—β1的ADSCs相结合有望构建组织工程软骨。; 方忠杨琴熊伟李光辉肖骏李锋; 关键词：脂肪干细胞 Β-磷酸三钙

藻酸钠微球介导髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响被引量：2: 2008年; 背景:椎间盘退行性变的理想治疗方法是利用组织工程技术修复退行性变的椎间盘,而修复所需的髓核细胞来源十分有限。目的:观察在藻酸盐微球的介导下,髓核细胞与骨髓间充质干细胞非接触共培养时,髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。设计、时间及地点:细胞学体外观察,实验于2007-10/2008-08在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和中心实验室进行。材料:4月龄健康新西兰大耳白兔5只,取髓核细胞与骨髓间充质干细胞原代培养,利用传代法分离纯化。方法:①将纯化的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化、收集,并与适量的藻酸钠溶液混合,形成109L-1的单细胞悬液,将混合好的单细胞悬液经注射器滴加至35g/L的CaCl2溶液中,形成海藻酸钙凝胶珠。②将海藻酸钠凝胶微球与髓核细胞共培养。在7d和15d时,分组溶解海藻酸钙凝胶珠,收集骨髓间充质干细胞。主要观察指标:利用免疫组化技术、RT-PCR技术和Westernblot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达,用以判断髓核细胞对骨髓间充质干细胞在非接触条件下的诱导作用。结果:在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可见,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖染色阳性,RT-PCR和Westernblot结果显示经诱导后骨髓间充质干细胞中已有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达,且诱导15d组的目的条带明显亮于诱导7d组的目的条带。结论:在藻酸盐微球的介导下,体外非接触共同培养时髓核细胞能够实现对骨髓间充质干细胞的诱导作用。; 周松李锋陈文坚周方宇牛朋彦方忠; 关键词：骨髓间充质干细胞髓核细胞

抽吸法诱导兔椎间盘退变模型的病理及影像表现被引量：6: 2009年; 背景:椎间盘退变的病理生理学机制至今尚未明了,需要构建更稳定和简便易得的椎间盘退变模型,观察其病理及影像表现,揭示其内在因素。目的:实验希望通过病理学及影像学检测,来验证利用抽吸法构建兔椎间盘退变模型的可行性、以及造模的简便和稳定性。材料:10月龄健康新西兰大耳白兔42只,雌雄不拘,随机分为对照组和实验组各21只。速眠新由长春市军需大学兽医研究所提供。方法:设两组兔椎间盘高度指数均为100%。利用21G皮肤穿刺针分别在实验组白兔L4～5单节段刺入,抽吸髓核8～12mg造模;对照组不做处理。造模完毕,两组兔分别于4,12,20周各取7只进行指标检测。主要观察指标:利用椎间盘高度指数百分比、X射线片、MRI及Alcianblue组织染色观察退变椎间盘的变化。结果:4,12,20周实验组退变椎间盘高度指数百分比分别为(81.0±3.2)%,(75.0±2.5)%,(71.0±1.8)%,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。退变椎间盘T2加权像信号明显降低,Alcianblue组织染色显示退变椎间盘组织中聚集蛋白多糖含量明显降低。结论:抽吸法构建兔椎间盘退变模型简便可靠,其退变过程的病理及影像表现与人椎间盘退变过程的病理及影像表现十分相似。; 周松李锋陈安民方忠陈文坚牛鹏彦; 关键词：抽吸法椎间盘退变

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