重庆市教委科研基金(KJ100309)
- 作品数：3 被引量：8H指数：1
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- 相关机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：重庆市教委科研基金国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究被引量：6
- 2012年
- 目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse lineprobe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3’、5’对称加有poly-C的特异性探针和5’标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5%以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100%,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09%(103/105)、100%(43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.
- 赖国旗张文露胡源唐红张磊谢素兰潘玥魏立雯黄爱龙
- 关键词：乙型肝炎病毒拉米夫定
- 丙型肝炎病毒P7蛋白体外原核表达状况的研究被引量：1
- 2011年
- 目的:扩增丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus,HCV)P7蛋白基因,克隆到多个原核表达系统,观察P7蛋白在体外表达的情况,获取具有生物学活性的HCVP7重组蛋白。方法:设计扩增全长HCVP7基因片段的特异引物,以H/FL质粒DNA(含HCV1acDNA全长序列)为模板,通过PCR扩增全长HCV P7基因,定向克隆到pQE30、pGEX 4T-2、pET32a(+)3种不同类型的原核表达载体中。将重组后包含HCVP7基因的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或SG13009(PREP4),并做异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定HCV P7蛋白原核表达的情况。结论:获得可溶性的重组蛋白GST-HCVP7和Trx-HCVP7,为进一步研究P7蛋白的生物学功能奠定基础。
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- 关键词：丙型肝炎病毒原核表达
- 含阿德福韦酯耐药突变位点的HBV聚合酶逆转录酶区域的原核表达被引量：1
- 2011年
- 目的原核表达含阿德福韦酯(Adefovir,ADV)耐药突变位点的HBV聚合酶逆转录酶(Reverse transcriptase,RT)区域。方法以野生型HBV DNA为模板,PCR扩增HBV聚合酶RT区域,克隆至质粒pHis-SUMO上,构建重组表达质粒SUMO-RTWT,并通过定点突变构建含ADV耐药突变位点(181T/V+236T)的突变质粒SUMO-MT1和SUMO-MT2,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析,并进行表达条件的优化及HBV聚合酶RT区域的结构建模。结果重组表达质粒SUMO-RTWT、SUMO-MT1和SUMO-MT2经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合;经表达条件优化后,3种重组质粒在大肠杆菌Roset-ta(DE3)中均获得有效稳定的表达;同源结构建模结果表明,HBV聚合酶RT区域具有典型的DNA聚合酶的结构。结论已成功构建了含ADV耐药突变位点HBV聚合酶RT区域的重组原核表达质粒,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得稳定表达的可溶性目的蛋白,为研究ADV的耐药机制奠定了基础。
- 谢素兰黄爱龙蔡雪飞胡源
- 关键词：阿德福韦酯融合蛋白原核细胞
