广东省科技攻关计划(2008A020100020)
- 作品数：11 被引量：31H指数：4
- 相关作者：丁壮宣华李志杰张泉鹏王贵平更多>>
- 相关机构：吉林大学广东省农业科学院吉林农业科技学院更多>>
- 发文基金：广东省科技攻关计划吉林大学研究生创新基金资助国家农业科技成果转化资金项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- RNAi靶向N基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制被引量：7
- 2010年
- 根据编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)基因的序列,设计3个干扰靶位(N12、N23、N26),构建siRNA表达载体,转染Marc-145细胞后接毒,测定病毒TCID50、CPE,并利用实时荧光定量PCR及间接免疫荧光检测病毒在Marc-145细胞上的复制情况。结果表明,利用RNAi技术靶向N基因,其中N12干扰靶位可以高效抑制PRRSV的增殖,证实N基因可能是病毒复制所必需的结构基因,所选的干扰靶位是病毒复制的关键性位点。
- 杨闽楠李志杰丁壮张泉鹏宣华王贵平
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因RNA干扰
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒JL/07/SW毒株GP5基因及猪IL-18基因融合蛋白真核表达系统的建立
- 目的利用pEGFP-N1载体构建了含有PRRSVJL/07/SW毒株GP5基因及猪IL-18基因融合蛋白真核表达载体pEGFP-IL18-GP5。方法采用RT-PCR方法扩增了JL/07/SW毒株GP5基因和猪IL-18...
- 高磊李国江丁壮张立春
- 关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征GP5基因IL-18基因真核表达
- 文献传递
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒JL07SW株Nsp9基因的序列分析及原核表达被引量：1
- 2011年
- 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株及变异毒株(HB-1、SY0608、HN-HW、HuN4等)的核苷酸序列,利用Primer软件设计合成针对PRRSV Nsp9基因保守区域的特异性引物。用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,基因克隆至表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28a-Nsp9,转化BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为34.8 kD,表达量占菌体蛋白的40.32%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步制备抗Nsp9单抗及建立区分野毒和灭活毒感染的ELISA方法提供物质基础。
- 黄志强张学东丁壮张泉鹏宣华
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达
- PRRSV ORF6及IL-18基因重组真核质粒试验免疫研究被引量：4
- 2011年
- 将本实验室构建的重组质粒接种PRRSV的自然宿主断奶仔猪,分析其诱发细胞免疫和体液免疫应答的能力。结果表明:重组质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6免疫组在首免后14d开始产生特异性抗体,且其产生抗体水平随时间呈上升趋势,但pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6两组之间产生抗体差异不显著(P>0.05)。中和抗体检测结果显示只有pEGFP-ORF6在首免后42d有低水平的中和抗体产生。细胞免疫检测结果表明,pEGFP-IL18-ORF6诱导T淋巴细胞增殖和促进IFN-γ和IL-2的分泌的能力显著高于pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18(P<0.05),表明IL-18有效地发挥了分子其佐剂的效用,能增强细胞免疫应答并介导较好的Th1类免疫反应。
- 牛伟王中华王晓莉宋德武母连志丁壮
- 关键词：ORF6基因IL-18
- 靶向GP5基因脱氧核酶抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制被引量：3
- 2011年
- 针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JL/07/SW株GP5基因设计了4个脱氧核酶,经体外切割试验筛选得到具有体外切割活性的脱氧核酶,并通过RT-PCR、TCID50、CPE、间接免疫荧光(IFA)检测具有切割活性的脱氧核酶抑制PRRSV复制效果进行评价。结果针对GP5基因的Dz-GP5-10抑制效率最高可达到82.4%,Dz-GP5-12也表现良好的抑制效果,表明GP5基因的这2个位点可能是PRRSV复制所必需的。本研究为PRRSV复制及基因组功能研究、抗病毒药物开发和转基因动物研究奠定了基础。
- 宋德武袁洁李鑫郭育培杨建新宣华王贵平丁壮
- 关键词：PRRSV脱氧核酶GP5基因
- 2006年-2008年河南省PRRSV分子流行病学调查被引量：4
- 2011年
- 根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的NSP2,ORF5-7基因的核苷酸序列,设计合成5对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出10株PRRSV河南地方株的NSP2和ORF5-7片段,将扩增片段克隆到pMD-18T载体并进行测序。应用DNAStar序列分析软件对分离株的NSP2和ORF5-7基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的PRRS毒株进行了同源性比较,结果表明PRRSV河南分离株的NSP2和ORF5-7基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%-98.1%和81.4%-96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.7%-61.7%和44.7%-45.9%;同时将PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因的推导氨基酸序列与其他美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因发生了变异。
- 邱骏张学东沈志强赵军张泉鹏丁壮
- 关键词：PRRSVNSP2基因
- RNAi靶向GP5基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在MARC-145细胞中的复制被引量：7
- 2010年
- 针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JL/07/SW株GP5基因设计了3个RNA干扰靶位,构建shRNA表达质粒;将转染干扰质粒6 h后的MARC-145细胞接种病毒,并通过Real-time RT-PCR、TCID50、CPE、间接免疫荧光检测(IFA)对所设计的shRNA表达质粒的干扰效果进行评价;结果表明,构建的干扰质粒可以高效抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制,说明GP5基因的这3个干扰靶位可能是PRRSV复制所必需的。本试验为PRRSV复制及基因组功能研究、抗病毒药物开发和转基因动物研究奠定了基础。
- 宋德武李志杰王晓莉宣华王贵军丁壮
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因
- PRRSV缺失变异毒株JL/07/SWM基因克隆与原核表达
- 2009年
- 根据PRRSV VR-2332毒株核苷酸序列,设计针对M基因的特异引物,以PRRSVJL/07/SW毒株细胞培养物为模板,利用RT-PCR方法,成功扩增出M基因,将该基因与原核表达载体pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达。测序结果表明:M基因全长525 bp,编码175个氨基酸,经同源性比较及进化树分析该毒株属于美洲型。表达产物经SDS-PAGE及Western blot结果证实;PRRSVJL/07/SW毒株GP5基因成功地进行了原核表达,分子量约为43 000,表达的目的蛋白占菌体总蛋白含量的19.8%。
- 李志杰丁壮彭龙宣华王贵平丛彦龙母连志
- 关键词：PRRSVM基因克隆原核表达
- PRRSV变异株ORF6基因与IL-18共表达真核质粒的构建及其表达被引量：2
- 2010年
- 针对白细胞介素18(IL-18)基因和本实验室分离的PRRSVJL/07/SW毒株全基因序列,分别设计了2对特异性引物,扩增出IL-18基因和ORF6基因。将2个目的基因克隆于真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了重组真核质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6,阳性质粒转染Marc-145细胞进行筛选。通过表达载体在转染细胞中的高效转染,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)快速、准确的反映出阳性质粒在细胞质中的正确表达,再通过SDS-PAGE和Western blot鉴定构建的真核表达质粒pEGFP-IL18-ORF6的正确性。结果表明,ORF6基因和IL-18基因在Macr-145细胞中能有效表达。结论,所构建的真核质粒pEGFP-IL18-ORF6结构正确,能够在Marc-145细胞中高效表达,而且表达产物具有特异免疫学反应。
- 王晓莉李志杰丁壮张泉鹏宣华王贵平
- 关键词：PRRSV
- PRRSV GP5蛋白及猪IL-18基因共表达核酸疫苗免疫原性试验被引量：4
- 2011年
- 本试验通过分子克隆技术分别构建了单独表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因以及PRRSVGP5基因和猪IL-18基因共表达的重组核酸疫苗质粒(pEGFP-GP5和pEGFP-IL18-GP5),并进行仔猪免疫原性研究,对构建的PRRSV核酸疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫水平进行检测,进一步研究了PRRSV核酸疫苗免疫效果以及猪IL-18基因对PRRSV核酸疫苗免疫调节作用的影响。同时,调查了商业上应用不同类型的PRRSV疫苗诱导的免疫效果,并与核酸疫苗免疫效果进行比较。结果表明,IL-18作为免疫佐剂在疫苗免疫猪后诱导的病毒特异性细胞免疫反应方面具有很好的调节作用,共表达IL18-GP5蛋白能够明显的改善DNA疫苗的免疫效力,增强抗PRRSV的免疫保护。因此,DNA疫苗做为一种新一代疫苗可用于对抗高致病性PRRSV感染。
- 沈宪文王中华高磊李国江丁壮
- 关键词：PRRSVGP5基因
