国家自然科学基金(30170675)
- 作品数：5 被引量：41H指数：3
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- 韩红兵徐署光连正兴陆泉枝李宁
- 关键词：CDNA克隆
- 文献传递
- 电穿孔导入绿色荧光蛋白基因于绵羊胎儿成纤维细胞研究被引量：21
- 2004年
- 本文应用质粒pEGFP Cl带有水母绿色荧光蛋白 (GFP)基因和新霉素抗性基因 (Neor)两种报告基因转染胎儿成纤维细胞 ,进行转染条件优化。首先 ,通过成活率确定转染脉冲时程和场强 ,发现有三种组合是最适的组合 ,它们分别为 :时程 5ms,场强 1.2 5～ 1.5kV/cm ;时程 15ms时 ,场强 1.0～ 1.2 5kV/cm ;时程 2 5ms时 ,场强 0 .75～ 1.0kV/cm。接着采用场强 1.2 5kV/cm ,时程 15ms ,研究转染的温度、电导介质、细胞状态、DNA用量和细胞密度对转染效率的影响 ,结果表明电导介质为Dhanks,DNA用量为 4 μg/mL ,对数期细胞密度为 1× 10 6～ 1× 10 7个 /mL ,电击前后在 4℃下各静置 10min时 ,能获得最佳转染效率。
- 王海陆泉枝连正兴李宁吴常信
- 关键词：绿色荧光蛋白基因纤维细胞
- 体外培养山羊成纤维细胞系方法的建立被引量：11
- 2006年
- 用山羊组织块和0．25％的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞，对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题，则根据两者贴壁紧实程度不同，用0．05％的胰酶-EDTA进行不同时间的消化，将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后，进行冷冻一解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明，在体外培养至20～30代成纤维细胞的细胞形态（为梭形细胞，高度汇合后呈火焰状）、细胞周期以及核型均为正常，符合体细胞克隆转基因的基本要求。
- 潘求真田亮徐曙光韩红兵李佳李海孙书锋连正兴杨宁李宁谭景和
- 关键词：山羊成纤维细胞体外培养
- 山羊体细胞转基因方法的探讨被引量：6
- 2004年
- 转基因体细胞核移植是制备高效表达转基因动物的主要手段与方法,但由于插入位点、拷贝数不同常使外源基因的表达受到一定影响。本试验以双正向选择标记的pLoxP M为转基因结构,以磷酸钙法、脂质体介导法、电击转染三种方法对山羊胎儿成纤维细胞进行转染。电击(1 70×10-4)和脂质体(1 36×10-4)法明显高于磷酸氢钙法(4 6×10-5),而且三方法的转染效率与细胞类型无关,但电击转染方法简单并适合于不同大小的转基因结构,对长片段更为实用。随机整合的转基因细胞系绿色荧光蛋白的表达水平有很大差异,主要与外源基因的拷贝数和插入位点有关。双正向选择标记不但可以筛选重组体而且可以体外监控外源基因的表达情况,为高表达转基因动物的制备提供了良好的手段与方法。
- 潘求真陆泉枝王海敖红连正兴李宁吴常信
- 关键词：山羊体细胞转基因方法胎儿成纤维细胞细胞核移植
- 应用PCR技术鉴定绵羊胎儿成纤维细胞系性别被引量：2
- 2002年
- 根据牛、羊Y-染色体性别决定区域(SRY)的同源性设计了一对PCR引物,对8个绵羊胎儿成纤维细胞系SFF1-8进行了性别鉴定。阳性对照和细胞系SFF1、2、6、7扩增得到130bp片段,阴性对照、空白对照及细胞系SFF3、4、5、8没有扩增带。通过序列测定和同源性分析,证明PCR产物为SRY基因片段,说明有130bp扩增带的细胞系为雄性;无扩增带的为雌性。结果表明,该法具有简单、快速、准确的特点,可应用于转基因克隆动物研究中对体细胞系的早期性别鉴定。
- 李湘萍潘求真石德顺李宁
- 关键词：PCR技术绵羊性别SRY基因
