中央高校基本科研业务费专项资金(2010SCV21004)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 携带HR-GFP报告基因的DNA损伤同源重组修复检测系统的建立及初步应用
- 2013年
- 目的建立DNA损伤同源重组修复检测系统(Ⅰ-Sce I-HR),应用该系统制备DNA双链断裂(DSB)的人骨肉瘤细胞(U2OS)模型,探索细胞DNA损伤后的修复特性奠定基础。方法通过分子克隆构建携带Ⅰ-Sce I归位内切酶识别序列的真核表达载体pcDNA3-HR-GFP,将该质粒转染入U2OS细胞中,经G418稳定筛选。随后分别瞬时转染入携带归位内切酶Ⅰ-Sce I的表达质粒pCBASCEI,以及体外经Ⅰ-Sce I线性化pcDNA3-HR-GFP。48小时后用免疫荧光方法检测DNA双链损伤效应分子-γ-H2AX,同时观察EGFP荧光信号;72小时后用Western blot检测报告蛋白EGFP的表达,评估DNA双链断裂后同源重组修复情况。结果酶切鉴定和测序证实pcDNA3-HR-GFP真核表达载体构建成功;Ⅰ-Sce I-HR系统引入U2OS细胞中后,γ-H2AX表达明显上调,荧光显微镜和Western blot均显示EGFP表达。结论 DSB细胞同源重组修复模型构建成功,Ⅰ-Sce I-HR系统能够成功地诱导U2OS细胞株产生DSB,并出现同源重组修复,为进一步研究DNA同源重组信号传导提供了有效的研究工具。
- 邓昭敏李莎李明远王欢任来峰郭连娣刘聪丁娜娜
- 关键词：同源重组DNA双链断裂
- RPA32蛋白原核表达、多克隆抗体制备及初步鉴定
- 2012年
- 目的原核表达人RPA32蛋白并制备其多克隆抗体,为后续RPA32的功能研究奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建原核表达质粒PET41a-RPA32,转化受体菌E.coli BL21,经IPTG诱导表达,采用GST亲和纯化方法获得GST-RPA32融合蛋白,将该融合蛋白免疫家兔制备RPA32多抗血清,最后采用Western blot检测其在多种肝细胞株中的特异性。结果在受体菌E.coli BL21中成功诱导表达GST-RPA32融合蛋白,免疫家兔后获得高效价RPA32抗血清,Western blot检测证实该血清能够识别多种肝细胞株中的RPA32及CPT作用后出现的RPA32磷酸化条带。结论成功制备兔抗人RPA32多克隆抗体,为RPA32在DNA损伤中的功能研究奠定了基础。
- 左斌王欢王海斌曾鸣任来峰李莎郭莲娣李明远
- 关键词：原核表达多克隆抗体
