福建省自然科学基金(C0710041)
- 作品数：5 被引量：23H指数：4
- 相关作者：程通夏宁邵张涛张军张雅丽更多>>
- 相关机构：厦门大学更多>>
- 发文基金：福建省自然科学基金福建省科技重大专项教育部科学技术研究重大项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的人工miRNA的构建与鉴定被引量：1
- 2010年
- 趋化因子CCR5是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,通过抑制CCR5的表达可以在一定程度上阻断HIV-1的复制进程.miRNA介导的RNA干扰相比经典的siRNA在应用中具有更多的特点.本研究的目的是构建可特异有效靶向CCR5的人工miRNA元件.本研究以CCR5基因序列为模板设计了14个miRNA靶序列,以天然miR-30a为基础骨架通过靶序列区替换构建人工miRNA元件.通过将miRNA表达质粒与携带靶序列区的报告质粒的共转染抑制实验检测不同miRNA的抑制效率,结果显示miCCR-13A具有较好的抑制效率和特异性.进一步将miCCR-13A表达载体转染CCR5阳性的HIV-1受体细胞株TZM-b1,RT-PCR检测显示miCCR-13A可在细胞中获得有效表达,同时应用免疫流式细胞术检测显示在miCCR-13A转染细胞相比对照细胞的CCR5蛋白的检测活性明显降低.进一步的研究显示miCCR-13A在细胞中不会影响细胞活性和干扰素效应相关基因osa1和stat1 mRNA水平,具有良好的特异性.本研究获得的可特异靶向CCR5的人工miRNA元件可为进一步的抗HIV-1研究提供重要基础.
- 王颖彬程通魏丽华张涛梁露萍夏宁邵
- 关键词：CCR5RNA干扰
- 人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化被引量：5
- 2009年
- 人乳头瘤病毒假病毒可广泛应用于中和抗体鉴定和疫苗免疫性评估等研究.本研究对多质粒共转染293FT细胞生产HPV假病毒的方法进行了深入优化,结果显示不同的HPV结构蛋白表达质粒转染比例对于假病毒生产效率有显著的影响,HPV主要结构蛋白L1的表达水平是影响生产效率的主要因素,L2表达质粒的用量过高或过低均不利于假病毒的生产,而报告质粒的用量对假病毒生产效率的影响相对较小.综合比较显示,在该体系中L1和L2表达质粒和报告质粒以合适比例(如1∶1/10∶1/2)进行共转染可获得更为理想的生产效率.本研究同时也在293FT细胞中对磷酸钙转染方法进行了优化,通过磷酸钙与质粒用量的交叉配比试验获得了较优的转染条件.通过优化,建立了更为高效的HPV假病毒大量制备方法,在HPV16、HPV18、HPV6、HPV11假病毒生产中的应用结果显示较原方法可显著提高生产效率.本研究为HPV假病毒中和实验的规模化应用提供了有利条件.
- 郑舟周国栋张雅丽张涛杨炳春邱竹英程通张军夏宁邵
- 关键词：人乳头瘤病毒表达质粒
- 重组慢病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究被引量：4
- 2008年
- 慢病毒是一种具有独特优点和巨大应用潜力的哺乳动物细胞基因转移载体,我们对慢病毒载体对不同哺乳动物细胞的基因转移及表达效率进行了平行比较研究.应用第三代重组慢病毒系统构建了携带CMV启动子-EGFP报告基因表达元件的重组慢病毒Lenti-EGFP,分别对多种不同哺乳动物细胞进行转导实验,在转导48 h后应用流式细胞仪检测报告基因在不同细胞株中的转移及表达效率.我们共使用了29种哺乳动物细胞株,包括14种人类组织细胞,5种猴组织细胞,9种鼠组织细胞,1种兔组织细胞.结果显示,重组慢病毒具有良好的基因转移能力,可有效进入多数哺乳动物细胞,对不同种属来源的细胞没有表现出特别的偏嗜性,但对贴壁培养细胞的基因转移效率明显高于对悬浮培养细胞.本研究为重组慢病毒系统的合理使用提供了基础.
- 张雅丽程通蔡毅君张涛魏丽华杨炳春郑舟张军夏宁邵
- 关键词：慢病毒绿色荧光蛋白哺乳动物细胞
- 靶向HIV-1 vif的高效人工miRNA的构建及慢病毒介导的体外抗病毒研究被引量：8
- 2010年
- RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础。vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点。miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势。本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi。本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达。miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miR-NA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当。与携带靶序列的荧光素酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性。用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制。实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好。进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平。miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础。
- 张涛程通魏丽华张雅丽王颖彬蔡毅君张军夏宁邵
- 关键词：RNA干扰HIV-1VIF
- 靶向HIV-1pol的高效人工miRNA的构建与体外抗病毒能力评价被引量：7
- 2010年
- RNAi技术在抗HIV-1治疗研究中已显示出巨大潜力,获得可高效特异抑制HIV-1的RNAi元件是进行相关研究的重要基础。miRNA在抑制和表达方式上相比siRNA具有更多的优势。本研究即探讨构建可高效特异靶向HIV-1的人工miRNA元件。选择以保守性较好的HIV-1pol基因为靶区筛选高效保守的RNAi序列,设计了16个可靶向pol区高保守区段的RNAi靶点,构建表达载体与HIV-1感染性克隆进行共转染抑制实验,筛选显示pol1026序列兼具高保守性及高抑制效率特点。以天然miR-30a为基础骨架构建了靶向pol1026靶点的人工miRNA元件,通过与HIV-1感染性克隆质粒的共转染抑制实验验证获得了可有效抑制HIV-1表达的人工miRNA元件(miR-1026E)。通过与携带靶序列的报告质粒的共转染实验证明miR-1026E具有良好的靶点特异性。本研究进一步构建了携带miR-1026E表达元件的重组慢病毒,转导MT-4细胞并对转导后细胞进行克隆化筛选,获得稳定整合miR-1026E表达元件的MT-4-miR1026E细胞克隆,该细胞在体外攻毒实验中可高效抑制HIV-1的复制,具有显著的抑制HIV-1的能力。同时应用实时RT-PCR方法检测显示,miR-1026E在细胞中不会影响内源性代表miRNA(miR-181与miR-16)的表达水平和干扰素效应相关基因stat1的表达水平,具有良好的特异性。所获得的可特异高效抑制HIV-1复制的人工miRNA元件可为抗HIV-1研究提供重要参考。
- 程通张涛张雅丽魏丽华夏德镇王颖彬张军夏宁邵
- 关键词：RNA干扰HIV-1POL
