国家自然科学基金(20774094B040203)
- 作品数：8 被引量：10H指数：2
- 相关作者：柳长柏王琥黄宇彬钟春燕马节兰更多>>
- 相关机构：三峡大学中国科学院杭州市第三人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金湖北省科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 温度、血清以及肝素等因素对TAT穿膜效应的影响
- 2010年
- 目的:探讨在不同实验条件下,二甲基亚砜(DMSO)预处理培养细胞对TAT穿膜效率的影响。方法:体外培养Caski、A549、HepG2及COS7细胞株在不同实验条件下与荧光标记多肽TAT或无意义肽NCO共孵育。荧光显微镜观察TAT-FITC的穿膜效率及其胞内定位;荧光酶标仪定量测定细胞内荧光强度。结果:10%DMSO预处理37℃和4℃下各细胞株后,TAT-FITC均可高效穿膜入胞,且胞浆、胞核中均匀分布,胞核浓度高于胞浆;相同条件下未见NCO-FITC穿膜进入细胞。无血清组(Caski:1881±66、HepG2:2112±74、A549:2126±59)血清组较有血清组(Caski:1312±90、HepG2:1308±11、A549:1370±22)细胞内荧光强度大,且有显著差异(P<0.05)。抑制剂Heparin存在时,Caski细胞荧光强度则明显减弱(加肝素组:1208±29,加肝素组:895±56;P<0.05)。结论:10%DMSO预处理不同培养细胞在37℃和4℃条件下均可提高TAT的穿膜效率,血清和Heparin可减弱DMSO的穿膜增强效应。
- 王琥柳长柏黄宇彬
- 关键词：二甲亚砜TAT血清肝素
- 糖类高渗化合物对TAT穿膜效率的影响
- 2010年
- 目的研究糖类高渗化合物葡萄糖、蔗糖或甘露醇预处理细胞对TAT穿膜效率的影响。方法人工合成荧光标记多肽TAT-FITC和无意义肽NCO-FITC,将其作用于体外培养的人宫颈癌细胞株Siha、小鼠成纤维细胞L929及人肝癌细胞株HepG2。荧光酶标仪定量检测不同预处理对各细胞摄取荧光标记短肽的影响及内吞抑制药阿米洛利对不同预处理后TAT穿膜的影响;荧光显微镜观察不同预处理后,TAT-FITC的穿膜效率及其在Siha细胞内的定位;MTT检测不同预处理对Siha细胞存活率的影响。结果糖类高渗化合物预处理细胞后,TAT-FITC可高效穿膜进入细胞内,且在胞浆、胞核中均匀分布,胞核浓度高于胞浆浓度;未见NCO-FITC穿膜进入细胞。0.6mol·L-1葡萄糖预处理后,细胞摄取TAT-FITC的荧光强度较0.6mol·L-1蔗糖预处理后相近且较对照组明显增强(P<0.01),0.5mol·L-1甘露醇预处理的荧光强度次之。加入阿米洛利后,糖类高渗化合物预处理的细胞摄取TAT-FITC荧光强度均明显减弱(P<0.01)。MTT数据显示适当浓度的糖类高渗化合物对细胞的活力有轻微影响。结论0.6mol·L-1葡萄糖或0.6mol.L-1蔗糖或0.5mol·L-1甘露醇预处理均可提高TAT对培养细胞的穿膜效率,但对细胞活力影响较小;预处理后细胞可能以内吞方式摄取TAT-FITC短肽。
- 柳长柏王琥马节兰黄宇彬
- 关键词：葡萄糖蔗糖甘露醇
- 病毒入胞机制对载药多肽设计的启示被引量：1
- 2011年
- 目的了解病毒入胞、内含体逃逸等机制,从中得到启发为进一步设计开发高效智能、仿病毒载药工具提供帮助。方法纵观在长期的进化过程中病毒因宿主的杀伤压力,为生存、复制延续所形成的独特的跨膜、内含体逃逸以及亚细胞器定位等本领,揭示其给我们在仿病毒载药多肽设计开发方面的启示。结果与结论对病毒感染机制全面、深入的了解,有助于我们利用病毒逃避宿主杀伤机制,为设计、研发高效率非病毒载药多肽提供新思路。
- 马节兰柳长柏
- 关键词：病毒药物输送
- 多肽介导的生物活性分子细胞靶向及胞内运输策略被引量：1
- 2009年
- 细胞膜屏障在保护细胞正常形态和功能的同时,也使很多有治疗作用的生物活性分子难以进入细胞内,使其应用受到极大限制。目前常用的向细胞内导入生物大分子的方式主要有电穿孔和脂质体转染等,但因其对细胞有较大毒性而多局限于体外实验研究。近年来,基于多肽的药物输送载体以其安全性、低毒性、低免疫反应性、靶向性及易于组装等优点被寄予厚望。本文就多肽在生物活性分子胞内运输过程、提高输送效率的策略作一综述。
- 王琥柳长柏
- 关键词：肽类核定位信号细胞穿透肽药物输送
- 促进细胞穿透肽及其介导的生物分子从内含体逃逸的几种策略被引量：6
- 2009年
- 细胞穿透肽(CPPs)是一类可穿透细胞膜、向细胞内输送各种大分子生物活性物质的短肽。几乎所有CPPs及其介导的生物活性分子都是以内吞形式进入细胞,之后局限于内含体内,以至于最终被溶酶体消化降解,从而影响了CPPs的运输效率,故寻找辅助CPPs及其介导的生物活性分子从内含体中逃逸进入胞浆的方法尤为重要。目前的体外研究多用氯喹或Ca2+处理以提高CPPs的运输效率。最近有学者报道使用天然多肽或微生物的某些"元件"(如,流感病毒的HA2肽)来协助CPPs从内含体逃逸,将有助于CPPs作为高效运载工具向细胞内输送生物活性分子。
- 王琥柳长柏
- 关键词：肽类溶酶体药物输送
- DMSO增强原核表达TAT-EGFP（Apoptin）穿膜效应的研究
- 2009年
- 目的：构建pET15b-TAT-EGFP和pET15b-TAT-Apoptin,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的定位及TAT-Apoptin的诱导Caski凋亡活性。方法：人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET15b后再连接EGFP和Apoptin基因,组成pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子。转化大肠杆菌,1mMIPTG诱导TAT-EGFP（Apoptin）融合蛋白表达,His亲和层析柱纯化。培养的Caski细胞经过10%DMSO处理1h后,加入融合蛋白孵育1h,观察TAT-EGFP进入细胞的情况。同时用TUNEL检测TAT-Apoptin诱导Caski凋亡的情况。结果：成功地构建了高表达pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子,纯化了分子质量约为30KD的融合蛋白TAT-EGFP和17KD的TAT-Apoptin融合蛋白,并在体外培养的Caski细胞经10%DMSO处理后证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力明显增强。结论：通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了DMSO能够增强TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。
- 王琥钟春燕柳长柏
- 关键词：TAT融合蛋白转导
- HPV阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽PTP的穿膜特性研究被引量：2
- 2010年
- 目的:证实宫颈癌细胞特异性细胞膜穿透肽特异性穿膜并优化穿膜条件。方法:将编码人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽(PTP)的cDNA片断与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因片断融合,克隆至原核表达质粒pET15b克隆位点,构建pET15b-GFP-PTP重组原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达GFP-PTP融合蛋白,纯化后的GFP-PTP融合蛋白作用于体外培养的HPV阳性宫颈癌细胞株HeLa,Siha,肺癌细胞株A549及正常脐静脉内皮细胞ECV304。利用合成的标记短肽探讨优化穿膜条件。结果:荧光显微镜观察发现,与融合蛋白GFP-PTP共孵育后的Hela和Siha细胞胞浆及胞核内有绿色荧光均匀分布,而A549及ECV304胞内无绿色荧光。与GFP共孵育的任何细胞内均无绿色荧光。流式细胞术分析结果显示PTP对HeLa,Siha细胞的穿膜效率分别为33.2%和28.9%。10%DMSO处理细胞后可增强PTP特异性穿透HPV阳性宫颈癌细胞株的胞膜并改善胞浆内分布。结论:本研究结果为进一步探讨PTP作为宫颈癌防治的靶向导入载体奠定了基础。
- 钟春燕王琥柳长柏黄宇彬
- 关键词：宫颈癌
- 二甲亚砜或蔗糖预处理对TAT体外穿膜效率的影响被引量：2
- 2009年
- 目的研究二甲亚砜(DMSO)或蔗糖预处理细胞对TAT体外穿膜效率的影响。方法人工合成荧光标记多肽TAT-FITC和无意义肽NCO-FITC,将其作用于体外培养的人宫颈癌细胞株Caski、人肝癌细胞株HepG2及非洲绿猴肾细胞株COS7。荧光显微镜观察不同DMSO或蔗糖预处理后,TAT-FITC的穿膜效率及其在细胞内的定位;流式细胞仪及荧光酶标仪定量细胞对荧光标记短肽的摄取;10%DMSO或0.5mol·L-1蔗糖预处理后,荧光酶标仪定量内吞抑制剂NH4Cl和阿米洛利对荧光标记短肽摄取的影响。结果10%DMSO或0.5mol·L-1蔗糖预处理细胞后,TAT-FITC可高效进入细胞,且在胞浆、胞核中均匀分布,胞核中浓度高于胞浆;未见NCO-FITC穿膜进入细胞。10%DMSO预处理后,加入TAT-FITC的细胞荧光强度较0.5mol·L-1蔗糖预处理强,有显著差异(P<0.05)。加入2种抑制剂后,10%DMSO或0.5mol·L-1蔗糖预处理的、加入TAT-FITC的Caski细胞荧光强度均明显减弱(P<0.05)。结论10%DMSO或0.5mol·L-1蔗糖预处理均可提高TAT的体外穿膜效率,且预处理后TAT-FITC的穿膜途径仍为细胞内吞。
- 王琥柳长柏黄宇彬
- 关键词：二甲亚砜蔗糖细胞膜TAT
