国家自然科学基金(30872473)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
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- 制作胚胎干细胞饲养层细胞条件的优化被引量：2
- 2010年
- 背景:研究表明小鼠胚胎成纤维细胞的制作受多种因素的影响。目前对这些因素的研究均建立于半经验的基础上,缺乏客观定量的数据支持。目的:对小鼠胚胎成纤维细胞制作胚胎干细胞饲养层细胞条件进行优化。方法:用两种不同方法从孕13.5d昆明小鼠胚胎中分离胚胎成纤维细胞,采用锥虫蓝染色计数,比较两种分离方法在细胞活性和数量方面的差异。对分离得到的胚胎成纤维细胞用0.05%胰酶在室温下消化不同时间,分析胰酶消化时间解离贴壁细胞能力和其对细胞活性影响;采用梯度浓度国产丝裂霉素灭活饲养层细胞2h和2.5h并制作细胞生长曲线,探索丝裂霉素最佳浓度和处理时间;通过不同冻存方法比较复苏后胚胎成纤维细胞活性,筛选出适合小鼠胚胎成纤维细胞最佳冻存方法。结果与结论:胚胎成纤维细胞对胰酶极其敏感,短时间多次消化法方法显著提高细胞活性和数量;室温下4～6min胰酶消化时间有利于保存细胞活性;10mg/L2.5h和20mg/L2h丝裂霉素灭活适合制作饲养层细胞;程序性降温使细胞更能适应温度变化,显著提高解冻后细胞活性和数量。
- 张万里李伟林学科李航翟荣林王国斌陶凯雄
- 关键词：小鼠胚胎成纤维细胞胚胎干细胞饲养层细胞丝裂霉素
- 内皮素受体B基因启动子上游CpG岛甲基化对神经嵴细胞迁移的影响被引量：2
- 2009年
- 目的探讨内皮素受体B(EDNRB)基因启动子上游CpG岛甲基化对肠神经系统(ENS)发育中神经嵴细胞迁移的影响。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测2007年9月-2008年12月华中科技大学同济医学院附属协和医院经病理检查等证实的16例先天性巨结肠症(HD)患儿挛缩段组织标本中EDNRB基因启动子上游CpG岛甲基化状态;采用荧光定量PCR(SYBRGreen法)检测HD患儿病变组织标本(包括扩张段、移行段和挛缩段3段组织)中EDNRB基因mRNA的相对表达量。并收集同期16例非HD患儿的正常结肠组织标本作为对照。结果HD患儿挛缩段标本行MSP检测,甲基化率为12.5%(2/16例);非HD患儿正常组织均未发现甲基化。16例HD患儿病变组织标本(包括扩张段、移行段、挛缩段)荧光定量PCR检测发现2例甲基化病变组织标本(包括扩张段、移行段、挛缩段)中EDNRB基因表达水平较非甲基化组织明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在HD发病机制中,EDNRB基因启动子上游CpG岛甲基化可能对ENS发育中神经嵴细胞的迁移有一定影响。
- 王智勇王国斌王继亮陶凯雄
- 关键词：CPG岛甲基化甲基化特异性聚合酶链反应荧光定量聚合酶链反应
- 小鼠EDNRB基因启动子生物信息学分析被引量：5
- 2011年
- EDNRB/EDN3/ECE-1信号传导通路在胚胎发育期神经嵴细胞分化、迁移、发育为神经节细胞的过程中起到关键作用。采用进化足迹法,利用生物信息学在线软件分析先天性巨结肠相关EDNRB基因启动子序列,结果显示:小鼠EDNRB基因定位于14号染色体,编码442个氨基酸,分子量为:49430Da,转录起始点300bp左右可能为启动子区域,启动子区域包含长度为1473bp的CpG岛,存在两段保守序列,人类和小鼠保守区域内含有33个共同的转录因子结合位点。
- 张万里李伟吴川清林学科李航王国斌陶凯雄
- 关键词：EDNRB启动子生物信息学转录因子
- 胃癌临床病理特征与Line-1低甲基化关系被引量：2
- 2011年
- 目的 探讨Line-1（long interspersed nucleotide element-1）甲基化水平与胃癌临床病理特征的关系.方法 收取30例胃癌标本和癌旁正常组织,采用焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）对胃癌组织和癌旁正常组织Line-1甲基化水平进行检测.结果 30例胃癌患者胃癌组织中Line-1甲基化平均水平65.8%,而正常组织为75.1%,差异有统计学意义（P＜0.05）;30例胃癌组织中,Line-1甲基化水平在不同的发病性别、发病年龄、发生位置和分化程度中差异无统计学意义（P＞0.05）;Line-1甲基化程度与浸润深度（T1/T2：68.9%、T3/T4：61.3%）、淋巴结转移（NO：70.0%、N1：69.9%、N2：61.7%、N3：57.6%）和远处转移（MO：67.9%、M1：59.1%）明显相关（P＜0.05）,并且随着胃癌的进展而降低.结论 Line-1低甲基化与胃癌浸润和转移有关,可能参与胃癌的进展.
- 李伟韩高雄帅晓明陶凯雄王国斌
- 关键词：胃癌甲基化
- EDNRB基因CpG岛甲基化在先天性巨结肠发病机制中作用的初步探讨被引量：3
- 2009年
- 目的探讨内皮素受体B（EDNRB）基因启动子上游CpG岛甲基化在先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HD）发病机制中的作用。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测2007年9月至2009年3月收集的经病检等证实的25例HD患儿病变组织标本EDNRB基因CpG岛甲基化状态．以同期收集的16例非HD患儿正常结肠组织标本作为阴性对照，采用荧光定量PCR（SYBR-Green法）和Western-blot技术检测这15例HD患儿病变组织标本中EDNRB基因mRNA和蛋白的相对表达量。结果15例标本MSP检测．有2例发现甲基化，甲基化率为2／25（8％）；16例阴性对照均未发现甲基化。荧光定量PCR发现：甲基化组织EDNRB基因Ct值（扩张段0．13±0．08，移行段0．10±0．06．挛缩段（1．09±0．05）均较非甲基化组织（扩张段0．59±0．24．移行段0．57±0．32，挛缩段0．48±0．30）有明显下凋．差异具有统计学意义（P〈0．05）。Western-blot发现：甲基化组织EDNRB基因蛋白相对灰度值（扩张段1．56±0．43，移行段1.32±0．32．挛缩段1．27±0．21）较非甲基化组织（扩张段1．72±0．36．移行段1．52±0．62，挛缩段1．48±0．49）有所下降，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论内皮素受体B（EDNRB）基因启动子上游CpG岛甲基化可能通过影响其mRNA的表达水平导致其表观遗传学的改变．进而导致HD的发生。
- 王智勇王国斌王继亮陶凯雄
- 关键词：甲基化
- 妊娠期间高叶酸饮食诱导子代小鼠先天性巨结肠模型的研究被引量：1
- 2011年
- 目的观察母体妊娠期间高叶酸（FA）饮食在子代小鼠先天性巨结肠（HD）发生中的作用。方法分别用0（低叶酸组）、2（正常对照组），40、160、320mgFA／kg（高叶酸组）RHAA配方饲料补充孕小鼠，分别观察上述5组不同叶酸饮食环境下刚出生的仔鼠的结肠标本是否具有HD表型，并采取酶联免疫吸附试验（ELISA）检测孕鼠及仔鼠的血清叶酸浓度。结果随着饲料叶酸含量的升高，孕鼠及仔鼠血清叶酸浓度也呈相应逐渐升高，直至160mgFA／kg饲料饮食，母鼠及仔鼠体内叶酸水平达到最高值；低叶酸组与正常对照组仔鼠无巨结肠发生；在高叶酸组中：40、160、320mg3组巨结肠发生率分别为2．1％（1／42）、6．1％（2／33）、2．8％（1／36），并与仔鼠血清叶酸浓度密切相关。结论母体妊娠期间高叶酸饮食可以诱导仔鼠HD的发生，高叶酸饮食因素在HD发病机制中有着重要作用。
- 吴川清林学科陶凯雄杜寒松韩高雄李航帅晓明
- 关键词：叶酸饮食先天性巨结肠
- Bmi-1通过抑制p16基因的表达促进人胰腺癌细胞的增殖被引量：2
- 2013年
- 目的观察靶向下调Bmi-1基因对人胰腺癌细胞（PANC-1）细胞增殖、p16启动子甲基化、p16表达的影响。方法构建反义Bmi-1真核表达载体转染人人胰腺癌PANC-1细胞，运用荧光倒置显微镜观察、Western blot技术检测靶基因沉默效率；运用流式细胞术检测细胞周期及凋亡；Western blot、实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测p16基因表达；甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测p16启动子甲基化变化。结果荧光倒置显微镜观察转染后48h细胞转染效率在90％左右；细胞周期出现阻滞（Go／G，期细胞由40．52％上升至60．48％，P〈0．05）、凋亡增加（由7．87％上升至21．67％，P〈0．05）；Bmi-1蛋白表达水平明显下降[吸光度（IA）值318．54±1．21到175．39±0．73，P〈0．05]；p16启动子甲基化水平降低而p16基因RNA（从3．563±0．128上升到8．621±0．310，P〈0．05）及蛋白质表达上升（IA值213．38±0．54到304．12±0．76，P〈0．05）。结论本实验构建的反义Bmi-1载体能够有效沉默细胞中靶基因的表达，抑制细胞增殖；Bmi-1很可能通过甲基化的方式对p16的表达进行调控。
- 冷政伟夏清华殷涛陶凯雄
- 关键词：胰腺癌BMI-1甲基化P16
- 先天性巨结肠症神经干细胞移植研究进展被引量：1
- 2009年
- 先天性巨结肠症（Hirschsprung disease．HSCR或HD，也称先天性肠无神经节细胞症或先天性肠神经节细胞缺乏症）是一种以肠道末端肠壁和肌间神经丛副交感神经节细胞完全缺如为特征的消化道发育畸形。手术是治疗HD的首选方式，但存在术后近、远期并发症。有学者根据HD形成的机理，提出通过植入神经干细胞的方法，在外界刺激干预下，使神经于细胞在病变部位重新分化形成神经元和神经节细胞，达到治愈HD的目的。
- 王智勇王国斌舒晓刚陶凯雄
- 关键词：先天性巨结肠症神经干细胞移植交感神经节细胞消化道发育畸形无神经节细胞症肌间神经丛
