河南省科技攻关计划(0224630174)
- 作品数：14 被引量：36H指数：3
- 相关作者：邢莹刘瑞敏韩雪飞李克鄢文海更多>>
- 相关机构：郑州大学河南大学南阳医学高等专科学校第一附属医院更多>>
- 发文基金：河南省科技攻关计划国家重点实验室开放基金河南省医学科技创新人才工程项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人脐血间充质细胞体外分离培养方法及培养基特性被引量：12
- 2005年
- 目的:采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质细胞的方法。方法:实验于2003-11/2004-10在郑州大学医学院干细胞中心完成。选择郑州大学医学院第三附属医院产科足月妊娠健康产妇的脐血用于实验(产妇均签署知情同意书),随机分为4组:低糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)组、高糖DMEM组、低糖DMEM+干细胞因子组、MsencultTM(一种特殊成分的液体培养基,与其添加物配合使用可促进间充质干细胞分化为脂肪细胞)组。待新生儿娩出后,立即断脐,消毒母侧脐带断端,60mL无菌注射针穿刺脐静脉取血,立即导入肝素抗凝的无菌采血袋内。取新鲜采集的脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,将脐血单个核细胞接种于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化。结果:①各组间充质细胞培养24h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较:MsencultTM组、低糖DMEM+干细胞因子组的贴壁细胞数明显多于高糖DMEM组、低糖DMEM组[(40.5±9.7),(31.5±4.2),(14.0±1.4),(7.5±1.6)个,P<0.05],细胞存活率亦明显高于高糖DMEM组、低糖DMEM组[(97.1±0.9),(95.3±2.6),(84.1±1.9),(81.2±1.1)%,P<0.05]。②各组间充质细胞在不同培养时间下生长状态的比较:培养第3,7,10,14天MsencultTM组、低糖DMEM+干细胞因子组细胞增殖的速度均快于高糖DMEM组、低糖DMEM组(P<0.05),且MsencultTM组细胞克隆数最多[(1±1.22),(0.83±0.75),(0.2±0.4),0个,P<0.05]。结论:采用低糖DMEM+干细胞因子与单纯MesencultTM培养基培养的细胞生长旺盛,但由于干细胞因子用量较大,价格昂贵,因此低糖DMEM联合应用干细胞因子的方法并不十分适用。而MesencultTM为酸性培养基,有利于脐血细胞的生长,并可形成克隆,为脐血间充质细胞的成功培养创造了条件,是一种适合脐血间充质�
- 刘素芳鄢文海韩雪飞阎明邢莹
- 关键词：干细胞
- 端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验研究被引量：3
- 2007年
- 目的:观察外源性hTERT基因的异位表达对人骨髓间质干细胞(MSCs)端粒酶活性及细胞生命周期的影响。方法:将携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)目的基因的质粒pEGFP-hTERT通过脂质体转染法转入人骨髓MSCs中,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。通过RT-PCR和PCR-ELISA对转染前后hTERT mRNA的表达情况及其对端粒酶活性的影响进行检测。将转染细胞在EGF和bFGF的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定。结果:未转染的人骨髓MSCshTERT mRNA表达阴性,且端粒酶呈阴性而转染hTERT基因的人骨髓MSCshTERT mRNA表达阳性,且端粒酶呈阳性。转染hTERT基因的人骨髓MSCs在体外已连续传到第35代,而未转染的人骨髓MSCs传到第20-25代左右已衰老死亡。转染hTERT基因的人骨髓MSCs经EGF和bFGF的联合诱导后,较多细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白(MAP2)和神经丝亚单位M(NF-M)表达增强。结论:外源性hTERT基因可以在人骨髓MSCs中获得异位表达,并能诱导人骨髓MSCs的端粒酶活性。外源性hTERT基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。
- 李克刘瑞敏韩雪飞马岚邢莹
- 关键词：间质干细胞端粒末端转移酶
- 不同细胞因子对间充质干细胞向神经细胞诱导分化的影响被引量：1
- 2005年
- 目的:探讨骨髓间充质干细胞体外培养条件及不同细胞因子对其向神经样细胞分化的影响。方法:实验于2003-10/2005-01在郑州大学干细胞研究中心完成。从正常人骨髓中分离获取骨髓间充质干细胞,体外培养扩增、纯化后,分3组对其进行诱导分化:①碱性成纤维生长因子组。②表皮生长因子组。③碱性成纤维生长因子+表皮生长因子组。诱导后行免疫细胞化学鉴定,用反转录-聚合酶链反应对培养及诱导前后的微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白mRNA的表达进行检测。结果:增殖培养3d即可见细胞分裂像和克隆单位,细胞可保持较高的增殖生长能力。碱性成纤维生长因子组和联合诱导组微管相关蛋白-2mRNA的表达高于表皮生长因子组,而表皮生长因子组比碱性成纤维生长因子组有较多的胶质纤维酸性蛋白mRNA的表达。结论:骨髓间充质干细胞可以在体外扩增、培养,并可向神经干细胞方向诱导。表皮生长因子能促进干细胞向胶质细胞方向分化,而碱性成纤维生长因子能促进神经干细胞向神经元分化。
- 马岚李克许煊慧韩雪飞邢莹
- 关键词：骨髓细胞分化神经元干细胞细胞因子类
- 端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验(英文)被引量：1
- 2007年
- 背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响。设计:重复测量实验。单位:郑州大学医学院干细胞研究中心。材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者。增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大Dr.ChantalAutexier馈赠。DH5α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠。方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2mL,经离心、洗涤及传代培养后备用。①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5
- 李克刘瑞敏韩雪飞马岚邢莹
- 关键词：间质细胞端粒逆转录酶
- 利用噬菌体表面展示技术克隆抗人DR5抗体可变区基因
- 2011年
- 目的:利用噬菌体表面展示技术制备抗人DR5单链抗体。方法:从抗DR5杂交瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv基因。将scFv与PAK100载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌XL1-Blue,经VSCM13辅助噬菌体拯救,构建成鼠抗人DR5单链抗体库。以DR5作为固相筛选分子,对噬菌体展示肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第3轮洗脱物中随机挑选10个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,对所筛选克隆进行DNA序列测定和通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性。结果:经过3轮筛选后,对随机选取的10个噬菌体克隆进行鉴定,其中4个具有和DR5结合的特异性。结论:利用噬菌体表面展示技术筛选单链抗体,结果更加可信。
- 刘瑞敏王明丽季泽俊刘峰涛白慧玲马远方
- 关键词：噬菌体展示技术单链抗体死亡受体5
- 增强型绿色荧光蛋白转染豚鼠间充质干细胞的研究被引量：2
- 2005年
- 目的探讨增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为种子细胞标记物的可行性。方法构建EGFP逆转录病毒载体,转染豚鼠骨髓间充质干细胞(M SC),用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入HEK 293包装细胞内。经G 418筛选出阳性细胞克隆,取阳性克隆的病毒上清感染豚鼠骨M SC。筛选出稳定表达EGFP的M SC克隆,并向神经元方向诱导。检测神经元样细胞的特异性标志神经丝蛋白(NF)的表达。结果EGFP的逆转录病毒载体成功构建。病毒上清转染豚鼠M SC后,EGFP能稳定表达1个月以上,并且M SC细胞诱导后能表达NF。结论EGFP逆转录病毒载体易于构建成功并能在靶细胞中长期稳定表达,不影响细胞的分化特性,可以用作细胞标记。
- 韩雪飞刘瑞敏王永奎景莹贾敏鄢文海邢莹
- 关键词：绿色荧光蛋白间充质干细胞神经元
- 体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的研究被引量：7
- 2007年
- 通过体外诱导人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)向多巴胺(dopamine,DA)神经元分化,探讨人BMSCs来源的DA神经元的功能特征及其分化机制,为临床上细胞移植替代治疗诸如帕金森氏病(parkinson’sdisease,PD)等神经精神性疾病提供一种理想的细胞来源。通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs。50μmol/L脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophy factor,BDNF),10μmol/Lforskolin(FSK)和10μmol/LDA联合对BMSCs进行诱导。电子显微镜观察诱导2周后细胞是否具有神经元的超微结构特点;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测DA神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3和Lmx1b的表达;高效液相色谱(highperformance liquid chromatogram,HPLC)检测诱导2周后的细胞多巴胺的释放水平。结果表明,诱导2周后,电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成。RT-PCR结果显示NSE(neuron specificenolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学染色结果表明诱导2周后TH阳性细胞(24·80±3·36)%的表达较诱导3d后(3·77±1·77)%明显提高(P<0·01);HPLC检测到诱导2周后的细胞DA释放水平[(1·22±0·36)μg/mL(n=6)]高于未经诱导的细胞[(0·75±0·22)μg/mL(n=6)(t=-2·79,P=0·038)]。由此得出,BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs向DA神经元分化,并具有DA神经元的功能特征,是临床用于治疗神经精神性疾病的理想细胞来源。
- 柴立辉吴素霞鄢文海马远方
- 关键词：骨髓间充质干细胞分化多巴胺神经元脑源性神经营养因子
- EGFP逆转录病毒载体构建及在人骨髓间质干细胞中的表达
- 2009年
- 目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒载体,转染人骨髓间质干细胞(hMSCs),探讨EGFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法:构建携带EGFP基因的逆转录病毒载体,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入包装细胞,取阳性包装细胞克隆的病毒上清感染hMSCs,筛选稳定表达EGFP的细胞克隆(hMSCs-EGFP),MTT法测定hMSCs-EGFP的生长曲线。结果:病毒上清转染hMSCs后,绿色荧光蛋白能稳定表达一个月以上,生长曲线显示转基因细胞增殖速度和未转染细胞无明显差别。结论:hMSCs转染EGFP后,不影响其生长,EGFP可作为组织工程种子细胞良好的示踪剂。
- 刘瑞敏刘峰涛文曙光董硕邢莹
- 关键词：逆转录病毒载体人骨髓间质干细胞
- hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间质干细胞基因转移研究
- 2008年
- 目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(MSCs)中导入hTERT基因,观察该基因对细胞端粒酶活性的影响,能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法:PCR法扩增出hTERT全部片段,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞。检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达,端粒酶活性的变化,hTERT转入后对细胞增殖的影响。用5-氮杂胞苷将转基因细胞向心肌方向诱导,检测心肌特异抗体的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达,细胞端粒酶阳性。生长曲线显示转基因细胞增殖速度快于未转染细胞。向心肌细胞诱导后,心肌特异性抗体α-sarcom ericactin和connexin-43均有表达。结论:在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达,激活细胞端粒酶的活性,有效延长了细胞的寿命,不影响其分化功能。
- 李克刘瑞敏韩雪飞邢莹
- 关键词：间质干细胞脐血人端粒酶逆转录酶逆转录病毒载体
- 抗人DR5单链抗体噬菌体展示文库的建立和筛选被引量：3
- 2011年
- 目的应用噬菌体展示技术构建抗人DR5(death receptor 5,DR5)单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,从中筛选抗DR5 scFv。方法利用重组人DR5抗原免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸PCR将VH和VL基因拼接成scFv基因,以SfiⅠ位点定向插入PAK100噬菌粒载体,转化E.coli XL1-Blue,构建了库容为1×106的抗DR5单链抗体库。对抗体库进行5轮富集筛选后,phage-ELISA检测阳性克隆的抗原特异性,取1株阳性克隆进行测序分析。结果抗DR5 scFv基因序列长747 bp,编码249个氨基酸,具有和DR5结合的特异性。结论本文利用噬菌体抗体库筛选到了抗DR5 scFv,为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础。
- 刘瑞敏季泽俊孙颖川张爱红朱诗白白慧玲马远方
- 关键词：噬菌体展示技术死亡受体5单链抗体
